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苦参碱对肝癌细胞侵袭和迁移能力的影响

2020-09-29 272 上传者：管理员

摘要：目的研究苦参碱对肝癌细胞侵袭迁移能力及上皮型钙黏蛋白、神经型钙黏蛋白(N-cadherin)、波形蛋白表达的影响。方法体外培养肝癌SMMC-7721细胞,取对数期肝癌SMMC-7721细胞分为低、中、高剂量实验组及对照组,分别以0.25,0.50,1.00mg•mL-1苦参碱与等量生理盐水处理,各组均干预12,24,48h。用Transwell小室实验及WoundHealing法分别检测肝癌SMMC-7721细胞侵袭与迁移能力;用噻唑蓝(MTT)法检测肝癌SMMC-7721细胞增殖情况;用蛋白质印迹(Wb)法检测肝癌SMMC-7721细胞E-cadherin、N-cadherin、Vimentin蛋白的表达水平。结果干预48h时,对照组与低、中、高剂量实验组肝癌SMMC-7721细胞侵袭率分别为(70.02±3.41)%,(55.37±2.98)%,(32.51±3.43)%,(16.93±4.21)%;划痕愈合率分别为(60.22±3.89)%,(48.56±4.35)%,(29.64±3.96)%,(13.02±4.11)%。随苦参碱作用浓度增大,低、中、高剂量实验组肝癌SMMC-7721细胞增殖抑制率逐渐升高(P<0.05);与对照组比较,低、中、高剂量实验组肝癌SMMC-7721细胞侵袭率、划痕愈合率及N-cadherin、Vimentin蛋白相对表达量均显著降低,而E-cadherin蛋白相对表达量显著升高,且均呈剂量依赖性(均P<0.05)。结论苦参碱可有效抑制肝癌SMMC-7721细胞的增殖、侵袭和迁移能力,其作用机制可能与下调肝癌SMMC-7721细胞N-cadherin、Vimentin蛋白表达,同时上调E-cadherin蛋白表达相关。

关键词：
上皮型钙黏蛋白
侵袭
波形蛋白
神经型钙黏蛋白
肝癌
肝癌细胞
苦参碱
蛋白表达
迁移
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苦参碱是豆科植物苦参的主要活性成分之一,具有抗炎、镇痛、抗心律失常与抗肝纤维化等广泛的药理作用,临床上已广泛用于病毒性肝炎等肝病的治疗[1,2,3]。本研究旨在探讨苦参碱对肝癌细胞侵袭迁移能力的影响。

一、材料与方法

1、材料

细胞株SMMC-7721肝癌细胞株,购自中科院上海细胞库。

药品与试剂苦参碱(MAT),纯度:98.7%,规格:每支20mg,批号:110805-201709,中国食品药品检定研究院生产。DMEM高糖培养基,胎牛血清,均为美国Gibco公司生产;噻唑蓝(MTT)法试剂盒,美国Sigma公司生产;鼠抗人上皮型钙黏蛋白(E-cadherin),神经型钙黏蛋白(N-cadherin),波形蛋白(Vimentin)抗体,均为美国ProteintechGroup公司生产。

仪器IX-70光学倒置显微镜,日本Olympus公司产品;318MC酶标仪,上海精科公司产品;Image-ProPlus6.0软件,美国MediaCybernetics公司产品;QuantityOne4.4软件,美国Bio-Rad公司产品。

2、实验方法

2.1肝癌SMMC-7721细胞培养[4]4]

在37℃、5%CO2细胞培养箱内,用DMEM高糖培养基(10%胎牛血清、1%青-链霉素)常规培养肝癌SMMC-77221细胞,待细胞培养融合至70%左右,即可进行后续的实验。

2.2肝癌SMMC-7721细胞分组与给药方法

将对数期肝癌SMMC-7721细胞按1×104/mL的密度接种于96孔培养板,低、中、高剂量实验组与对照组分别以0.25,0.50,1.00mg·mL-1苦参碱与等量生理盐水处理,置于37℃、5%CO2的细胞培养箱中培养。

2.3主要观察指标

2.3.1用Transwell小室实验检测肝癌SMMC-7721细胞侵袭能力[5]5]

将Transwell小室放入24孔板中,下室加入含20%胎牛血清的培养液600μL,上室加入密度为1×104个/毫升的细胞悬液0.2mL,细胞分组与给药方法同2.2,每组设置2个复孔,实验重复3次;培养48h后取出Transwell小室,冲洗后用棉签轻轻擦去微孔膜上层细胞;多聚甲醛固定20min,苏木素染液染色5min。光学倒置显微镜下(×200)计数迁移至微孔膜下层的细胞,每个样本选取5个视野,取平均值。侵袭率(%)=微孔膜下层细胞数量/细胞总数量×100%。

2.3.2用WoundHealing法检测肝癌SMMC-7721细胞迁移能力[6]6]

将SMMC-7721细胞以5×104个/孔的密度接种于6孔板,当细胞汇合率达80%时,用200μL微量枪头垂直划痕;将划下来的细胞冲洗,细胞分组与给药方法同2.2,放入细胞培养箱中继续培养48h;在0,48h时分别于光学倒置显微镜下观察、拍照,用Image-ProPlus6.0软件计算细胞迁移距离和划痕愈合率。划痕愈合率=(0h划痕宽度-48h划痕宽度)/0h划痕宽度×100%。

2.3.3用蛋白质印迹(Wb)法检测肝癌SMMC-7721细胞E-cadherin、N-cadherin、Vimentin蛋白的表达水平[7]7]

将对数期肝癌SMMC-7721细胞以5×104个/毫升的密度接种于6孔板,细胞分组与给药方法同2.2;干预48h时,收集各组肝癌SMMC-7721细胞,离心弃上清液,加入预冷的RIPA细胞裂解液100μL提取细胞总蛋白,4℃下以1.2×104r·min-1离心15min,取上清液定量;取蛋白样品50μg进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳,转膜后封闭1h,分别加入一抗,4℃孵育过夜;加入二抗,室温孵育1h。显色后X线胶片曝光成像,以GAPDH为内参,经QuantityOne4.4软件进行半定量分析。

2.4次要观察指标——以MTT法检测肝癌SMMC-7721细胞增殖情况[8]8]

肝癌SMMC-7721细胞于37℃、5%CO2恒温培养至对数生长期时,胰酶消化,调整细胞密度为1×104个/毫升接种到96孔细胞培养板,继续培养24h后换液。细胞分组与给药方法同2.2,分别于干预12,24,48h时,每孔加入5g·L-1MTT20μL培养4h,吸去培养液后每孔加入二甲基亚砜(DMSO)150μL,待紫色晶体完全溶解后,用酶标仪测定570nm处的光密度(OD)值,实验重复3次。增殖抑制率(%)=(1-实验组OD570nm/对照组OD570nm)×100%。

3、统计学处理

用SPSS21.0软件进行统计分析。计量资料用x¯±s表示,多组间比较用单因素方差分析,符合正态分布且方差齐时,2组间比较Dunnett'st检验;不符合正态分布时,用秩和检验比较。

二、结果

1各组肝癌SMMC-7721细胞侵袭力比较

干预48h时,对照组与低、中、高剂量实验组肝癌SMMC-7721细胞侵袭率分别为(70.02±3.41)%,(55.37±2.98)%,(32.51±3.43)%,(16.93±4.21)%。与对照组比较,低、中、高剂量实验组肝癌SMMC-7721细胞侵袭率均显著降低,呈剂量依赖性(均P<0.05)。

2各组肝癌SMMC-7721细胞迁移能力比较

干预48h时,对照组与低、中、高剂量实验组肝癌SMMC-7721细胞划痕愈合率分别为(60.22±3.89)%,(48.56±4.35)%,(29.64±3.96)%,(13.02±4.11)%。与对照组比较,低、中、高剂量实验组肝癌SMMC-7721细胞的划痕愈合率均显著降低,且呈剂量依赖性(均P<0.05)。

3各组肝癌SMMC-7721细胞增殖抑制情况比较

干预12～48h,随苦参碱作用浓度增大,低、中、高剂量实验组肝癌SMMC-7721细胞的增殖抑制率逐渐升高(均P<0.05),见表1。

表1各组肝癌SMMC-7721细胞的增殖抑制率比较(x¯±s)

4各组肝癌SMMC-7721细胞E-cadherin、N-cadherin、Vimentin蛋白表达比较

干预48h时,对照组与低、中、高剂量实验组肝癌SMMC-7721细胞E-cadherin蛋白相对表达量分别为0.07±0.05,0.29±0.08,0.63±0.11,0.91±0.09;N-cadherin蛋白相对表达量分别为0.96±0.04,0.74±0.12,0.38±0.09,0.26±0.07;Vimentin蛋白相对表达量分别为0.93±0.07,0.81±0.10,0.57±0.11,0.08±0.04。与对照组比较,低、中、高剂量实验组肝癌SMMC-7721细胞N-cadherin、Vimentin蛋白相对表达量均显著降低,而E-cadherin蛋白相对表达量显著升高,且均呈剂量依赖性(均P<0.05)。

三、讨论

肝癌是我国最常见的恶性肿瘤之一,根治性切除机会少,同时术后复发率极高,而侵袭和迁移是其复发的主要因素[9]。苦参碱是从中药苦参中提取的一种生物碱成分,因具有诱导肿瘤细胞凋亡及抑制肿瘤细胞生长、抗炎、抗病毒等广泛的药理作用而用于癌症与慢性活动性肝炎的治疗[10]。本研究中,苦参碱呈剂量依赖性地抑制肝癌SMMC-7721细胞增殖,同时低、中、高剂量实验组肝癌SMMC-7721细胞侵袭率与划痕愈合率显著低于对照组,提示苦参碱可有效抑制肝癌SMMC-7721细胞的增殖,同时降低其侵袭和迁移能力。

上皮间质转化(EMT)是上皮细胞通过特定程序转化为具有间质表型细胞的生物学过程,在肿瘤侵袭和转移中发挥重要作用[11]。E-cadherin、N-cadhe-rin、Vimentin均是EMT过程中发挥重要作用的主要蛋白,miR-106a在肝癌中上调可促进肝癌细胞增殖、侵袭,其机制可能与抑制转化生长因子β受体2(TGFBR2)与E-cadherin,上调N-cadherin与Vimentin表达有关[12]。本研究中,与对照组比较,低、中、高剂量实验组肝癌SMMC-7721细胞N-cadhe-rin、Vimentin蛋白相对表达量均显著降低,而E-cadherin蛋白相对表达量显著升高,提示苦参碱可能通过下调肝癌SMMC-7721细胞N-cadherin、Vimentin蛋白表达,同时上调E-cadherin蛋白表达而有效抑制肝癌SMMC-7721细胞的侵袭和迁移能力。

参考文献：

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