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摘要:目的:探讨负载槲皮素(quercetin,QR)的含环醚侧基聚己内酯-聚乙二醇三嵌段共聚物(PECT)温敏水凝胶对大鼠脊髓损伤(spinal cord injury,SCI)的修复作用。方法:制备负载QR且37℃条件下自动成胶的温敏水凝胶(QR-polycaprolactone-polyglycol triblock,QR-PECT);表征水凝胶的温敏及流变特性;通过CCK-8实验评价水凝胶的细胞相容性;通过1,1-二苯基-2-吡啶并肼基(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl radical,DPPH)自由基清除实验来评估水凝胶清除自由基的能力;通过活性氧(reactive oxygen species,ROS)检测试剂盒评价水凝胶清除细胞内ROS的能力;制备大鼠SCI全切模型,分为Sham组、SCI组、QR治疗组及QR-PECT水凝胶治疗组,应用BBB评分评估大鼠运动功能的恢复,应用尼氏染色观察神经元迁移浸润情况,通过HE染色评价水凝胶生物相容性。结果:制备的QR-PECT聚合物在37℃条件下形成水凝胶,并持续释放QR;CCK-8实验定量结果显示QR-PECT水凝胶治疗组与SCI组的细胞活力相当;DPPH清除实验显示,QR-PECT水凝胶治疗组的DPPH清除率达到60%,与QR治疗组相当;通过测量HT22细胞内的ROS荧光值,发现QR-PECT水凝胶治疗组的HT22细胞内荧光强度显著降低;SCI后8周,QR-PECT水凝胶治疗组大鼠运动功能明显恢复,尼氏染色显示QR-PECT水凝胶治疗组存在大量神经元浸润,HE染色结果显示QR-PECT水凝胶治疗组心、肝、脾、肺、肾与正常大鼠没有明显的差异。结论:QR-PECT水凝胶具有良好的生物相容性和抗氧化性,并能够促进大鼠SCI后神经元的再生和运动功能恢复。
创伤性脊髓损伤(spinal cord injury,SCI)不可避免地引发急性炎症,随后发生多种病理事件,如广泛的细胞死亡、轴突脱髓鞘和胶质纤维化的发展,封闭充满液体的囊腔,这使SCI治疗极其困难[1-3]。因此损伤后微环境的调节对SCI修复具有重要意义。槲皮素(quercetin,QR)是一类黄酮类化合物,以其抗氧化和抗炎药理活性而闻名[4]。据报道,QR能够促进SCI后运动和电生理功能的恢复,减少空洞形成,此外还能增加脑源性神经营养因子,减轻组织损伤并促进轴突再生[5,6]。利用生物材料为内源性细胞和再生轴突提供基质支持,是一种很有前途的策略[7]。鉴于脊髓是一种高度水化的软材料,具有力学性质类似于天然细胞外基质的水凝胶,比刚性支架显示出显著的优势[1,8,9],例如,可以很好地避免机械错配导致组织损伤的风险[10,11]。
因此本研究构建了一种以温敏性水凝胶含环醚侧基聚己内酯-聚乙二醇三嵌段共聚物(polycaprolactonepolyglycol triblock,PECT)为载体,负载QR的缓释水凝胶支架(QR-PECT),植入大鼠SCI模型损伤区以桥接组织,持续释放QR,清除创伤部位ROS,调控SCI区免疫微环境,从而促进SCI区组织修复及运动功能恢复。
1、材料与方法
1.1材料
1.1.1实验动物
8周雌性SD大鼠20只,购于北京维通利华实验动物技术有限公司[SCXK(京)2021-0006],饲养于中国康复科学所SPF级动物饲养屏障内[SYXK(京)2021-0021]。饲养环境温度为20℃~26℃,相对湿度为40%~70%,环境噪声≤60 dB(A);动物自由饮食饮水,昼夜12 h更替。所有动物实验操作均经首都医科大学动物实验及实验动物福利委员会审核批准(AEEI-2021-185)。实验动物随机分为假手术(Sham)组、SCI组、QR治疗组及QR-PECT水凝胶治疗组,每组大鼠5只。
1.1.2主要试剂与设备
聚乙二醇、己内酯、辛酸亚锡,购于美国Thermo Fisher Scientific公司;二氯甲烷、乙醚、异氟烷、多聚甲醛,购于深圳市瑞沃德生命科技有限公司;注射用青霉素,购于华北制药有限责任公司;1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl DPPH)、CCK-8试剂盒、活性氧检测试剂盒、尼氏染色、H&E染色试剂盒,购于碧云天生物技术有限公司;QR,购于美国Sigma公司;DMEM培养基、0.25%胰酶、胎牛血清,购于美国Gibco公司。
1.2方法
1.2.1 QR-PECT水凝胶的制备
(1)PECT的合成[12]:将聚乙二醇加入到250 mL三口瓶中,将己内酯与TOSUO完全除水,之后加入辛酸亚锡,在130℃下反应12 h。加入二氯甲烷溶解粗产物,最后将其缓慢滴加到冷乙醚中,沉淀,过滤,干燥,得到最终产物PECT。(2)QR-PECT水凝胶的制备:采用共组装的方法制备QR-PECT纳米粒子。将3.5 mg槲皮素和500 mg PECT聚合物溶解在10 mL四氢呋喃中,然后将其缓慢滴加到200 mL蒸馏水中。使四氢呋喃缓慢挥发,最终得到QR-PECT纳米溶液。并且测定载药量和包封率,通过动态光散射(DLS)测定纳米粒子的尺寸,通过TEM观察纳米粒的形貌。
1.2.2 QR-PECT水凝胶的温敏及流变学研究
(1)QR-PECT水凝胶的温敏性研究:首先在室温下将QR-PECT冻干粉溶解到水中,将QR-PECT水溶液置于水浴锅中,设定温度为37℃,当温度达到37℃时,将小瓶拿出,翻转,观察溶液的流动性。(2)QR-PECT水凝胶的流变学研究:通过AR 2000ex流变仪对水凝胶的流变性能进行表征。温度扫描是测试温度从20℃~50℃,记录储能模量和损耗模量的变化。应变扫描是从0.1%~100%,固定扫描频率为6.28 rad/s,记录储能模量和损耗模量的变化。
1.2.3药物释放
将QR-PECT置于小瓶中,在37℃下维持12 h。随后加入5 mL PBS(pH=7.4),并以100 rpm震荡小瓶。在预设时间点,取出适量的上清液,并加入等体积的PBS。采用紫外-可见分光光度计测定374 nm处的吸光度,根据吸光度值计算QR累积释放量。
1.2.4细胞培养
将HT22/SH-SY5Y细胞株培养于含10%胎牛血清和1%双抗的DMEM完全培养基中,当培养瓶中细胞密度达到70%~80%则可进行传代。
1.2.5细胞活力测定
将HT22/SH-SY5Y细胞(每孔1×104)接种在96孔板上,将完全培养基与QR-PECT水凝胶以9∶1的比例配置成混悬液,每孔100µL加入到96孔板中,培养1、2和3 d后,采用CCK-8试剂盒检测细胞活力。
1.2.6 1,1-二苯基-2-吡啶并肼基(1,1-diphenyl-2-picry-lhydrazyl radical,DPPH)自由基清除
将20µL的QR-PECT水凝胶加入2 mL的DPPH溶液中,充分混匀,在黑暗处孵育30 min。随后,使用紫外-可见分光光度计测试混合物在520 nm处的吸光度,计算自由基的清除率。
1.2.7细胞内ROS水平的表征
HT22细胞以每孔1×104个细胞的密度接种到96孔板中。每组分别用200µmol/L的过氧化氢、QR和QR-PECT处理后,加入DCFH-DA,在37℃培养箱中孵育30 min。在488 nm激发波长,525 nm发射波长条件下使用荧光分光光度计测量荧光值。
1.2.8 SCI大鼠模型制备
用异氟烷与30%氧气和70%氮气的气体混合物麻醉大鼠:4%异氟烷诱导麻醉,2%~3%异氟烷维持麻醉。以T9~T10棘突为中心在背部切口,逐层剥离,暴露T9~T10棘突和椎板,咬除棘突和椎板,显露T9~T10节段待损伤脊髓。用锋利的无菌刀片横断脊髓并切除1.5 mm。Sham组仅行椎板切除术。QR治疗组造模后即刻将20µL QR溶液注射至损伤部位,QR-PECT水凝胶治疗组造模后即刻将20µL水凝胶支架植入脊髓横断处。SCI组造模成功后不做处理。各组术后皮下注射青霉素2×104U,连续7 d。每天给予下腹部按摩,挤压膀胱2~4次以帮助排尿,直至反射性排尿建立。
1.2.9尼氏染色
术后8周时麻醉实验大鼠,用4%多聚甲醛灌注,按照原切口暴露损伤段脊髓,取出损伤脊髓节段上、下各1 cm的脊髓组织,置于4%多聚甲醛48 h,依次经脱水、浸蜡、石蜡包埋后,10µm切片,甲苯胺蓝染色,光镜下拍照观察。
1.2.1 0 Basso-Beattie-Bresnahan(BBB)评分[1]
术后8周,每周采用BBB评分表评估各组大鼠行为学变化。
1.2.11 HE染色
术后8周时麻醉实验大鼠,用4%多聚甲醛灌注,依次取出大鼠心、肝、脾、肺、肾置于4%多聚甲醛中固定48 h,依次经脱水、浸蜡、石蜡包埋后,10µm切片,HE染色,光镜下拍照观察。
1.3统计学处理
使用GraphPad Prism 9软件进行数据分析和做图。计量资料以表示,2组间的比较采用t检验,3组间的比较采用two-way ANOVA,P<0.05为差异有统计学意义。
2、结果
2.1 PECT的合成
以PEG为引发剂,PCL和TOSUO为原料,辛酸亚锡为催化剂,130℃反应10 h,制备PECT聚合物。通过Bruker Avance III 400 M Hz仪器得到聚合物的核磁氢谱,见图1。
2.2 QR-PECT纳米粒子的制备
通过自组装的方法制备了QR-PECT纳米粒子,并通过动态光散射仪测试了纳米粒子尺寸[(89.2±0.37) nm,PDI=0.178],尺寸分布范围较窄。通过透射电子显微镜(TEM)观察纳米粒子的形态,粒子大小分布均匀,见图2,说明该方法制备了合适的QR-PECT纳米粒子。
图1 PECT合成过程及其核磁共振氢谱图
注:A:嵌段共聚物PECT的合成过程;B:PECT共聚物的核磁共振氢谱图。
图2 QR-PECT的合成路线及表征结果
注:A:QR-PECT的制备示意图;B:QR-PECT纳米粒子的粒径尺寸;C:QR-PECT纳米粒子的TEM图,标尺为200 nm。
2.3温敏及流变
之前的研究已经证明,随着温度的升高,水溶液中的PECT胶束可以组装成水凝胶。水凝胶形成的潜在机制为疏水作用诱导的胶束聚集。这种热敏性质为水凝胶的形成提供突出优势,包括以下几点:(1)水凝胶的可注射性,PECT胶束溶液可通过注射器进行注射;(2)形状适应力,在体内注射时,溶液将覆盖注射位置周围的组织并迅速变成不流动的水凝胶。因此,水凝胶将覆盖注射部位的创伤组织;(3)负载在水凝胶中的药物可以缓慢释放。此外,PECT水凝胶还具有良好的生物相容性。由于QR-PECT纳米粒子的聚集,QR-PECT随着温度的升高形成水凝胶,见图3A。纳米溶液在25℃时呈现流动溶液状态,当温度升高到37℃时,变成半固态凝胶状态,见图3B。流变学性能表明,当温度升高到30℃时,G’急剧增加,并且大于G’’,表明此温度是溶液-凝胶的转变点,见图3C。在36℃时,G’值最大,如果温度进一步升高,达到40℃以上时,凝胶变成沉淀。应变扫描表明,当应变增加到3%时,G’急剧下降,表现出剪切变稀特性,当达到7%时,G’值低于G’’值,表明水凝胶网络崩塌,见图3D。药物释放研究表明,QR逐渐释放,20 d时,药物累积释放量约为45%,见图3E。这些数据表明,水溶液中的纳米药物可在高温触发下自组装形成水凝胶,从而可以作为纳米药物持续递送支架。
图3 QR-PECT水凝胶的自组装和表征
注:A:QR-PECT水凝胶的温敏性研究示意图;B:37℃条件下溶胶-凝胶转变的小瓶翻转照片;(C~D)储能模量(G')与损耗模量(G'')随着温度和剪切应变的变化曲线;E:QR-PECT纳米粒子从水凝胶中累积释放量。
2.4 QR-PECT水凝胶的细胞相容性
选择HT22细胞作为模型细胞系。将细胞培养在水凝胶中,通过激光扫描共聚焦显微镜对染色的活细胞(绿色)进行3D重建。活细胞的3D重建结果显示,大量的活细胞均匀分布在QR-PECT水凝胶体系中。同时通过CCK8定量检测细胞的增殖速率。结果显示,水凝胶中的HT22细胞在培养的3 d内,其OD值不断增加,分别约为0.44、0.79和0.98。并且在培养的第3天,水凝胶中HT22细胞数量要明显高于对照组(P<0.05)。此外,SH-SY5Y细胞表现出与HT22细胞相似的增长趋势,两种细胞均保持了良好的增殖活性,见图4,以上结果表明,构建的QR-PECT水凝胶表现出良好的细胞相容性。
2.5 QR-PECT水凝胶的抗氧化性
水凝胶清除自由基的活性通过DPPH来检测,QR治疗组和QR-PECT水凝胶治疗组DPPH清除率均达到60%,2组差异无统计学意义,见图5。证明QR-PECT水凝胶可有效清除DPPH自由基。
图4 QR-PECT水凝胶的细胞相容性
水凝胶对于细胞内ROS的清除能力通过ROS检测试剂盒来验证。结果显示,HT22细胞经H2O2处理后,平均荧光强度明显增加,这表明H2O2引起了HT22细胞内的氧化应激,产生了大量的ROS。而损伤细胞经QR和QR-PECT水凝胶处理后,其细胞的平均荧光强度显著降低(P<0.0001),见图5。证明HT22细胞内的ROS可被QR-PECT水凝胶有效清除。
图5 QR-PECT水凝胶的抗氧化能力
注:A:DPPH自由基含量,(1)P<0.0001;B:HT22细胞内ROS的平均荧光强度,(1)P<0.0001。
2.6体内生物相容性评价
在体内治疗研究之前,首先对QR-PECT水凝胶在体内的生物相容性进行评估。取经QR-PECT水凝胶治疗8周的SCI大鼠心、肝、脾、肺和肾脏进行HE染色。染色结果显示QR-PECT水凝胶治疗组大鼠脏器并没有显示出明显的细胞炎症和水肿,同时定量分析心、肝、脾、肺和肾脏的细胞数量结果显示,QR-PECT水凝胶治疗组各脏器细胞数量与Sham组相比差异无统计学意义,见图6。这说明QR-PECT水凝胶在大鼠中没有引起显著的局部或全身毒性。
图6 QR-PECT的体内生物相容性
注:A:QR-PECT水凝胶移植8周后主要器官的组织切片(HE染色,×400);B:心、肝、脾、肺和肾脏的细胞数量定量结果。
2.7尼氏染色
采用尼氏染色法观察神经元的损伤情况。染色结果显示损伤后8周,SCI组尼氏小体数量明显变少,而QR-PECT水凝胶治疗组和QR治疗组尼氏小体数量要明显多于SCI组(P<0.001),其中QR-PECT水凝胶治疗组的尼氏小体数量最多,见图7。这表明QR-PECT水凝胶明显促进了SCI区神经元的再生,并且对神经的保护作用优于单纯的QR治疗组。
2.8 BBB评分
在术后3周,QR治疗组和QR-PECT水凝胶治疗组均显示出运动功能恢复的趋势,但与SCI组相比并没有显著差异。但术后5、7、8周,QR-PECT水凝胶治疗组BBB评分结果显著高于SCI组和QR治疗组(P<0.05),见图8。以上结果表明与单纯接受QR治疗相比,QR-PECT水凝胶治疗更有利于大鼠的运动功能恢复。
图7 SCI区尼氏染色结果
图8 3组大鼠各时间点BBB评分变化趋势
3、讨论
SCI是指各种原因导致的椎管内神经结构及其功能的损害,出现损伤平面或以下的脊髓功能紊乱[3]。SCI的病因分为创伤性和非创伤性两种,其中创伤性SCI所占比例高达90%,以青壮年居多,不仅会给患者本人带来身体和心理的严重伤害,还会对整个社会造成巨大的经济负担[13]。
过去几十年里,人们致力于开发有效的神经修复手段,其中基于细胞的再生医学是一种合理且有前途的治疗SCI的方法,通过补充新的神经细胞促进神经修复[14]。但移植细胞在恶劣环境中存活率较低,使其难以发挥作用[15]。目前已采用局部给予抗炎药物和神经保护因子的方法来改善损伤区域的恶劣环境。然而,由于脑脊液的快速消除和生物活性受损,这些方法的疗效仍然有限[16,17]。因此,构建具有理想功能的生物相容性支架来局部持续给药,是一个非常值得关注的领域。
QR是一类黄酮类化合物,广泛存在于多种中草药中,具有抗炎、抗氧化、抗癌、神经保护、免疫保护、抗病毒和抗菌等广泛的药理学作用[4,18-20]。但是直接用药作用时间较短,需要持续给药;因此,本研究采用温敏性水凝胶PECT包裹QR,形成QR-PECT复合水凝胶,以实现QR的局部持续给药。
良好的生物相容性是组织工程中水凝胶支架的基本要求[21,22],因此本研究首先对QR-PECT水凝胶体内体外的生物相容性进行评价。体外研究结果显示,QR-PECT水凝胶与HT22细胞共培养3 d后,QR-PECT水凝胶治疗组吸光度要明显高于对照组,这表明QR-PECT水凝胶促进了HT22细胞的增殖。此外QR-PECT水凝胶与SH-SY5Y共培养后吸光度差异无统计学意义。HE染色结果显示,QR-PECT水凝胶植入大鼠脊髓8周后,主要脏器心、肝、脾、肺、肾没有明显的病理变化,说明QR-PECT水凝胶具有良好的生物相容性。
SCI后导致微环境产生一系列的生理病理变化,损害再生过程[23]。氧化应激是细胞中活性氧或活性氮积累的结果,是SCI后局部微环境恶劣的主要因素之一[24]。自由基的过量产生可导致大分子,如DNA、蛋白质和脂质的改变,导致严重的细胞损伤甚至死亡[25,26]。因此,氧化应激的增加和炎症反应的加重是SCI后神经修复困难的主要因素[27]。这些因素会导致轴突变性和脱髓鞘,同时诱导神经细胞的坏死和凋亡,如神经元和少突胶质细胞[28]。这些生理病理改变也有利于损伤部位瘢痕的形成,严重阻碍轴突生长和组织再生[29-31]。因此,清除自由基,减少氧化应激的发生,重建一个有利的微环境至关重要。本研究结果显示,QR-PECT水凝胶对于DPPH自由基和细胞内ROS都具有良好的清除效果,与QR治疗组并无显著差别。这表明QR经PECT包裹后,并没有影响到QR本身的抗氧化作用。另外通过尼氏染色和BBB评分观察到,QR-PECT水凝胶治疗SCI大鼠后,其神经元再生数量和运动功能恢复情况都要优于QR治疗组。这可能是因为QR-PECT水凝胶实现了QR的局部持续给药,降低了炎症反应与氧化应激,改善了损伤区恶劣的环境,长时程的治疗使SCI大鼠实现了更好的神经恢复,更好地发挥了QR的神经保护作用。
综上所述,本研究构建了原位递送QR的PECT温敏水凝胶,证实了其优异的生物相容性、抗氧化性,同时将QR-PECT水凝胶应用到SCI大鼠后,发现水凝胶促进了损伤区神经元的再生和大鼠运动功能的恢复。缓释QR的PECT温敏水凝胶能有效修复大鼠SCI,并具有良好的临床转化前景。
基金资助:中央级公益性科研院所基本科研业务费专项资金项目(2021CZ-9)
文章来源:孙明明,张双悦,王秋颖,等.原位递送槲皮素的PECT温敏水凝胶对大鼠脊髓损伤的修复作用[J].神经损伤与功能重建,2024,19(07):373-378.
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