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敲低骨硬化蛋白对脉络膜黑色素瘤细胞的影响

2024-10-25 6 上传者：管理员

摘要：目的：探究敲低骨硬化蛋白(Sost)基因后，人眼脉络膜黑色素瘤细胞(MUM-2C)增殖和迁移功能的变化。方法：用人Sost干扰慢病毒转染MUM-2C细胞，构建Sost基因敲低的稳转细胞系(Sost-knockdown组),另一组不敲低Sost基因的MUM-2C细胞作为阴性对照(SostNC组)。用CCK-8法检测两组细胞的活性；用细胞划痕技术检测两组细胞的迁移量。结果：CCK-8法结果表明，随时间延长，Sost-knockdown组和SostNC组细胞的增殖活性均有增加，在同一时间点内观察，Sost-knockdown组细胞的增殖活性显著低于SostNC组(F=371.2,P<0.01);划痕试验结果显示，Sost-knockdown组细胞在第24小时的迁移量明显低于SostNC组；通过miRNAs测序选出Sost基因调控的Wnt/β-catenin信号通路上两组细胞中含量差异最显著的为miR-744-5p,通过RT-qPCR检测其含量，发现Sost-knockdown组显著低于SostNC组(F=235.8,P<0.01)。结论：当敲低Sost基因后，脉络膜黑色素瘤细胞的增殖及迁移能力显著降低。

关键词：
miR-744-5p
增殖
脉络膜黑色素瘤
迁移
骨硬化蛋白
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葡萄膜黑色素瘤是人眼内最常见的原发性恶性肿瘤之一，脉络膜是黑色素瘤(choroidal melanoma, CM)最常发生的部位。近年来CM发病率在全世界不断上升，由于其存在较长的潜伏期和隐匿转移的潜能，CM对50%以上的患者是致命的，其主要转移途径为血道转移，主要累及的部位是肝脏[1-2]。尽管目前该病的诊治已取得重大进展，但近30年间，患者5年相对生存率并未见显著提高。由于CM内在分子机制尚未被阐明，对该病患者来说尚无有效的解决方案。因此，了解导致该病发生的潜在信号通路有助于发现新的疗法[3]。microRNA(miRNAs)是微小单链非编码RNA,它的作用是调节基因转录后表达。通过与特殊靶向mRNA黏附，成熟miRNA可触发mRNA降解或抑制蛋白质翻译。miRNAs大多与细胞自身代谢活动、葡萄糖和脂质代谢以及人类肿瘤发生过程相关，而异常miRNAs通常作为致癌或抑癌因子出现[4]。骨硬化蛋白由Sost基因编码而成，它是经典Wnt/β-catenin信号通路的抑制剂[5]。研究发现，过表达的Sost可促进Wnt信号传导驱动前列腺癌骨转移倾向和侵袭[6],然而它在CM中的作用尚不清楚。本实验意在探究敲低骨硬化蛋白基因后，脉络膜黑色素瘤细胞增殖和迁移功能的变化。

1、材料与方法

1.1材料

1.1.1实验对象。

人眼脉络膜黑色素瘤细胞(MUM-2C)取材来自南开大学医学院馈赠。

1.1.2主要试剂及仪器。

胎牛血清、胰酶、双抗、PBS、高糖DMEM培养基均购自Gibco公司，人Sost干扰慢病毒（上海汉恒公司），TRIzol®Reagent(Invitrogen),cDNA试剂盒（Thermo Fisher),SYBR®Green Master(Roche),Lipofectamine 2000®Reagent(Invitrogen),miRNA抽提试剂及逆转录盒子（Qiagen),CCK-8细胞活性检测试剂（日本同仁），酶标仪（Thermo Fisher）。

1.2方法

1.2.1细胞培养。

在MUM-2C细胞中加入高糖DMEM完全培养基，于37℃、5%CO2恒温箱中孵育。当培养皿底贴壁细胞密度达70%～80%时，可进行传代培养。

1.2.2慢病毒转染。

第1天将状态良好的MUM-2C细胞消化并离心，接种至24孔板，使其密度为1×105个/孔，保证第2天汇合率在60%～70%之间。第2天吸除原有培养基，加入含人Sost干扰病毒和Polybrene的新鲜培养基，温育24h后除去旧培养基，PBS洗涤3遍并用新鲜完全培养基替换。转染48h后，用倒置荧光显微镜观察。转染后的细胞命名为Sost-knockdown组，取一组未转染的MUM-2C细胞作为阴性对照，命名为SostNC组。

1.2.3 CCK-8法检测细胞活性。

当细胞培养至状态良好时，用胰酶消化后离心，收集两组细胞，调整悬液浓度(100μL/孔)后滴入96孔板，放置37℃、5% CO2恒温箱中温育24h,以每孔10μL的浓度滴入CCK-8试剂，37℃条件下避光温育4h后，分别在第0小时、第24小时、第48小时用酶标仪测量其在450nmλ处吸光度。

1.2.4划痕试验检测细胞迁移。

当细胞悬液浓度为1×105个/L时，将两组细胞铺到6孔板中，待汇合率达70%～80%时，用100μL枪头沿着与板底垂直的方向轻轻划痕，吸除废液，PBS洗涤3遍，加入无血清培养基，并在37℃、5%CO2孵箱中温育24h,用倒置显微镜观察细胞移动轨迹并拍照留存。

1.2.5 miRNAs测序。

将Sost-knockdown和SostNC两组细胞进行miRNAs基因测序，找到受Sost基因调控的Wnt/β-catenin信号通路上差异量显著的miRNAs进行后续实验。

1.2.6 RT-qPCR检测miR-744-5p含量。

慢病毒转染后，提取Sost-knockdown组和SostNC组细胞中miRNAs,取1μL于分光光度计下测量其浓度及纯度。用miRNA逆转录盒子将样本逆转成相应cDNAs,并稀释4倍待用，每个样本设3个复孔。反应步骤为：第一阶段95℃预热15min,第二阶段94℃15s, 55℃30s, 70℃30s(总共40 circles)。以U6为内参，正向引物5’-ACACTCCAGCTGGGTGCGGGGCTAGGGCTA-3’,反向引物5’-CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGTGCTGTTA-3’,记录各孔CT值，取平均值，采用2-ΔΔCt法对结果进行统计分析。

1.3统计学方法

运用SPSS22.0软件进行数据统计分析，计量数据采用均数±标准差表示，两组间比较采用独立样本t检验，多组间比较采用单因素方差分析，在不同时间点进行重复测量时采用重复测量资料的方差分析。将P<0.05作为差异有统计学意义的标准。

2、结果

2.1 CCK-8法

随时间延长，Sost-konckdown组和SostNC组细胞增殖活性均有所增加，在第24小时和第48小时观察可知，Sost-konckdown组细胞增殖活性显著低于SostNC组，差异具有统计学意义(F=371.2,P<0.01),见表1。

表1两组细胞在不同时间点内增殖活性

2.2划痕试验

Sost-konckdown组细胞在第24小时的迁移变化量明显低于SostNC组，见图1。

图1划痕试验结果

2.3 miRNAs测序

根据KEGG富集分析结果，筛选出在Sost基因调控的Wnt/β-catenin信号通路上相关的9条miRNAs。其中，miR-744-5p在Sost-knockdown与SostNC两组细胞中含量差异最大，故选其作为目的miRNA,见图2。

图2Sost-knockdown组细胞相对于SostNC组中不同miRNAs表达含量差异的比较

2.4 RT-qPCR检测miR-744-5p含量

miR-744-5p分子在Sost-knockdown组细胞中含量(0.14±0.018)显著低于其在SostNC组细胞中含量(0.26±0.017),差异具有统计学意义(F=235.8,P<0.01)。

3、讨论

脉络膜黑色素瘤作为一种原发性眼内肿瘤，其治疗方法多样，包括眼球摘除术、眶内容物摘除、化疗及生物免疫疗法等。目前，眼球摘除术仍为治疗该病的常用方式，但术后患者的生存率未见明显提高，且预后较差。尽管目前对于脉络膜黑色素瘤的研究已经有较大进展，但在治疗方面的进展依旧不大，特别是对该病的眶内扩散及远处转移，仍无十分有效的治疗方法。因此早期的分子诊断对于提高患者生存率和减少肿瘤远处转移具有重要意义。骨硬化蛋白是骨形成过程中起负调节作用的因子，它由Sost基因编码而成，是经典Wnt信号传导通路的抑制剂。有文献称，乳腺癌细胞致骨转移的能力与骨硬化蛋白的表达水平密切相关，抑制骨硬化蛋白表达可以提高乳腺癌细胞致骨转移的能力[7]。Sost敲低后通过激活Wnt/β-catenin信号通路，可促进视网膜母细胞瘤细胞的增殖、侵袭和迁移，同时减少细胞的凋亡[8]。而过表达的Sost可促进Wnt信号传导驱动前列腺癌骨转移倾向和侵袭[9]。

miRNAs作为小分子核苷酸，并不直接编码，而是与其特定靶基因黏附，从而影响下游mRNA转录及蛋白质翻译。研究表明，miR-744被认为是肿瘤相关基因，miR-744通过同时抑制PDCD4和PTEN促进MMP-9介导的喉鳞癌转移[10]。而在宫颈癌中，miR-744则通过调节Bcl-2抑制凋亡诱导其生长和发展[11]。miR-744亦通过激活Wnt/β-catenin途径增加胰腺癌的致瘤性[12],通过ARHGAP5的转录控制鼻咽癌的进展和转移[13]。Wnt信号通路在肿瘤发生和维持组织稳态中具有调节作用[14]。目前发现Wnt信号传导通路与多种肿瘤细胞的增殖和迁移功能相关，尤其是与黑色素瘤的关系。研究认为与黑色素瘤相关的Wnt/β-catenin通路主要参与黑色素瘤细胞的增殖与迁移等过程[15]。近年来随着骨硬化蛋白对Wnt/β-catenin通路的调控在骨质疏松方面的研究日趋成熟，与之相关的Wnt相关通路也进入黑色素瘤研究视野[16-17]。

基于上述结论，本实验尝试将脉络膜黑色素瘤细胞中Sost基因敲低，并与未进行干扰的MUM-2C细胞进行对比，发现敲低Sost基因后，MUM-2C细胞的增殖活性和迁移能力均有显著下降，这一结果表明Sost基因可能对脉络膜黑色素瘤细胞的生长和转移有抑制作用，这为以后脉络膜黑色素瘤的靶向治疗提供了新的蛋白位点和可能性。本实验又在Sost基因调控的Wnt/β-catenin信号通路上选取变化差异显著的miRNAs分子，进一步探究该通路上何种miRNA可显著影响Sost基因功能，进而影响CM的发生发展。实验结果表明，在敲低Sost基因后，MUM-2C细胞中miR-744-5p分子含量显著下调，其潜在的调控机制可能是，Sost基因敲低后，miR-744-5p分子含量随之降低，从而抑制了Wnt/β-catenin信号通路的传导。而miR-744-5p分子是通过调控何种蛋白进而抑制该通路传导，是本研究后续需进行的工作。本实验为前期实验，Sost基因通过调控Wnt/β-catenin通路上miR-744-5p分子进而影响脉络膜黑色素瘤细胞的增殖和迁移，这一猜想仍需后续补足Wnt通路上β-catenin蛋白分子含量及表达变化的实验进行验证，使该调控通路和机制研究更加完整。这一发现也为未来针对脉络膜黑色素瘤的分子诊断和靶向治疗提供了新疗法和新思路。

文章来源:李冠瑜,刘增业,黑璐宁.敲低骨硬化蛋白对脉络膜黑色素瘤细胞的影响[J].医学理论与实践,2024,37(20):3437-3439.