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多发性骨髓瘤血浆循环游离DNA定量检测和完整性分析

2024-07-29 21 上传者：管理员

摘要：目的:研究血浆循环游离DNA（cf-DNA）在初诊多发性骨髓瘤（MM）患者筛查诊断中的作用，并探讨经化疗后患者的cf-DNA含量和完整性的变化在疾病评估中的作用。方法:收集35例初诊MM患者和18例健康志愿者的外周血标本，另选取MM患者中完成规范诱导化疗3个疗程的13例患者作为随访组。以ALU247片段及ALU115片段为目的基因，用荧光定量PCR检测患者及健康志愿者血浆中的cf-DNA含量，并以ALU247/ALU115比值计算cf-DNA的完整性。结果:MM患者ALU247、ALU115片段浓度和cf-DNA完整性均显著高于健康志愿者（均P<0.05）。经3个疗程诱导化疗的患者治疗后的ALU247和ALU115片段浓度以及cf-DNA的完整性均较治疗前显著降低（均P<0.05）,且治疗前后cf-DNA完整性与血清M蛋白含量及骨髓异常浆细胞比例之间均存在较强正相关关系(rM蛋白=0.703,r骨髓浆细胞=0.705)。结论:cf-DNA对于MM的筛查诊断具有一定的积极意义。cf-DNA或许可以协同或者替代血清M蛋白含量及骨髓异常浆细胞比例评估患者的病情、疗效及预后。

关键词：
ALU115
ALU247
初诊多发性骨髓瘤
完整性
循环游离DNA
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多发性骨髓瘤(MM)是仅次于非霍奇金淋巴瘤的第二大常见血液系统恶性肿瘤，约占所有恶性肿瘤的1%和造血系统肿瘤的13%[1-2]。MM好发于老年人，中位发病年龄66岁，随着我国社会老龄化进程的加快，MM的发病率迅速增长，预计将成为影响我国居民健康的主要疾病之一[3]。目前，诊断和评估MM病情的主要手段为血清或尿液M蛋白、骨髓穿刺细胞学及病理组织学检查，而骨髓穿刺及病理学检查具有创伤大、可重复性较差、不易被患者接受等缺点。近年来循环游离DNA(circulating cell-free DNA,cf-DNA)成为液体活检领域一个重点研究方向。cf-DNA是存在于血液、脑脊液、尿液等体液并游离于细胞外的DNA。早在20世纪40年代，Mandel等[4]首次报道了人类血液中cf-DNA的存在。直到20世纪70年代，Leon等[5]发现肿瘤患者血循环DNA的水平显著高于正常人，cf-DNA的相关研究才得到更多关注。研究表明，cf-DNA携带有关遗传和表观遗传肿瘤特异性改变的信息[6]。cf-DNA在肺癌、乳腺癌、卵巢癌、胰腺癌、肝细胞癌等多种实体肿瘤中具有预测复发、评价疗效及判断预后的重要作用[7-8],而目前有关cf-DNA在MM中的相关研究报道相对少见。为进一步明确cf-DNA在MM中的价值，本研究采用qPCR法检测MM患者的cf-DNA含量及完整性，分析其在MM的诊断、筛查及评估病情、疗效中的临床意义，从而为临床提供更加精确和有价值的参考。

1、资料与方法

病例资料

收集2021年1月-2022年1月就诊于皖南医学院弋矶山医院的初诊MM患者共35例，其中男性23例，女性12例，中位年龄67(32-81)岁。结合Durie-Salmon(D-S)分期系统、ISS分期系统及R-ISS分期系统分别对患者进行分期。根据D-S分期，ⅡA期4例，ⅡB期3例，ⅢA期14例，ⅢB期14例；根据ISS分期，Ⅰ期1例，Ⅱ期11例，Ⅲ期23例；根据R-ISS分期，Ⅰ期1例，Ⅱ期22例，Ⅲ期12例。选择同期门诊体检健康成人18例作为健康对照组，其中男性9例，女性9例，中位年龄27.5(24-45)岁。所有患者均排除妊娠、糖尿病、心脑血管疾病、肝肾功能不全及自身免疫性疾病。

试剂与仪器

本研究所用试剂与仪器包括：cf-DNA提取试剂盒(广州达安基因股份有限公司的核酸提取纯化试剂盒);离心机(德国艾本德5424/5424R高速冷冻离心机);qPCR预混合溶液品牌(Hieff® qPCR SYBR Green Master Mix(Low Rox Plus),美国Yeasen, 11202ES08);qPCR扩增仪(ABI life荧光定量PCR仪Q3,美国，Thermo Fisher);游离DNA样本专用真空采血管(康为世纪生物科技有限公司)。

cf-DNA提取

分别采集MM未治疗前、化疗3个疗程后以及健康志愿者外周血10 ml,注入cf-DNA专用抗凝管中。采集的外周血置于常温条件下储存，并于8 h内进行实验。将外周血以1 503×g离心10 min,取1 ml上清液，21 130×g离心10 min,取200μl血浆。再按照血浆cf-DNA提取试剂盒说明书提取cf-DNA,提取后置于-80℃保存备用。

引物设计及qPCR反应体系配置

cf-DNA定量检测使用qPCR技术，以提取的血浆cf-DNA为模板，以ALU115和ALU247为目的基因[9-13],通过qPCR技术进行检测。PCR反应体系配制：于冰上制备反应混合液，扩增条件为：95℃预变性5 min, 95℃10 s, 60℃30 s,循环28次后进行熔解曲线分析。每个样本重复检测2次。本实验根据人管家基因ALU重复序列设计的两对引物(ALU115和ALU247)的上下游序列见表1。

标准曲线的绘制及cf-DNA水平的计算

将已知浓度的人基因组DNA(100 ml)作为标准品，标准稀释5个梯度，建立标准曲线，浓度分别为10、2、0.4、0.08和0.016 ng/μl;根据标准品的浓度梯度建立标准曲线，并根据标准曲线对内参基因进行定量分析以及绘制熔解曲线，cf-DNA的完整性则以ALU247含量与ALU115含量的比值计算。

统计学分析

所有数据的分析均使用SPSS 26.0软件进行，采用Levene检验法进行方差齐性检验、Shapiro-Wilk法进行正态性检验，经验证数据不符合正态分布，故两组计量数据比较采用Mann-WhitneyU检验。数据不服从双变量正态分布，故数据相关性检验采用Spearman相关性分析，相关系数取值范围在[-1,1],系数<0代表负相关，>0代表正相关，0则代表不存在相关关系。P<0.05表示差异有统计学意义。

2、结果

MM组与健康对照组之间cf-DNA含量及完整性结果比较

MM组ALU247和ALU115两个基因片段浓度及cf-DNA完整性(ALU247/ALU115)均高于健康对照组，比较差异具有统计学意义(均P<0.05)(图1)。

ROC曲线分析

根据MM组及对照组的cf-DNA含量及完整性结果做ROC曲线，分析cf-DNA含量及完整性在疾病诊断时的特异性及敏感度，得出ALU247、ALU115、ALU247/ALU115曲线下面积分别为0.849(95%CI:0.737-0.961,P<0.05)、0.811(95%CI:0.688-0.935,P<0.05)和0.703(95%CI:0.565-0.842,P<0.05)。当采用ALU247的cut-off值29.800 ng/ml时，其敏感度为85.7%,特异性为88.9%;当采用ALU115的cut-off值107.343 ng/ml时，其敏感度为74.3%,特异性为88.9%;当采用完整性的cut-off值0.571时，其敏感度为57.1%,特异性为100%(图2)。

cf-DNA含量及完整性与患者临床特征间的关系

将患者按年龄、性别、D-S分期、ISS分期、R-ISS分期、肌酐值等临床特征进行分组分析，结果显示，各组cf-DNA含量及完整性均未发现明显统计学差异(P>0.05)(表2)。

随访患者cf-DNA含量和完整性的变化

对患者组中13例完成了3个疗程规范诱导化疗的患者进行为期3个月的随访，检测其cf-DNA的含量和完整性。治疗后ALU247片段浓度的中位值为29.410(14.339,67.927)ng/ml,较治疗前164.753(60.918,382.178)ng/ml明显降低(P<0.05);治疗后ALU115片段浓度的中位值为76.337(47.714,108.824)ng/ml,较治疗前210.676(86.995,486.689)ng/ml明显降低(P<0.05);治疗后cf-DNA完整性的中位值为0.366(0.311,0.612),较治疗前0.719(0.569,0.937)亦明显降低(P<0.05)(图3)。

随访患者cf-DNA完整性与血清M蛋白含量、骨髓异常浆细胞比例之间的关系

随访发现，治疗后患者血清M蛋白含量和骨髓浆细胞比例均较治疗前明显降低(均P<0.05)(表3);相关性分析显示，血清M蛋白含量和骨髓浆细胞比例与完整性之间的相关系数分别为0.703和0.715。

3、讨论

cf-DNA是一种在外周血和其他体液中发现的细胞外短双链DNA片段[14],健康供者外周血中的cf-DNA含量为10-100 ng/ml,远低于癌症患者，而晚期转移性癌症患者中的cf-DNA可达5 000 ng/ml[15-16],表明cf-DNA的水平与肿瘤负荷之间存在相关性。

在生理条件下，死亡细胞通过巨噬细胞或其他清除细胞介导的吞噬作用被清除，释放的cf-DNA片段在大约10-15 min内被肝脏、脾脏和肾脏分解，因此，cf-DNA的生理水平较低。在病理条件下，cf-DNA水平的升高是由细胞大量死亡、肝脏不能充分分解DNA片段所致[17]。此外，在肿瘤患者中，cf-DNA不仅可以从肿瘤细胞中释放，还可以从周围细胞中释放。同时肿瘤患者血浆中核酸酶活性降低，cf-DNA的清除率降低，使得cf-DNA含量进一步升高[18]。

本研究定量分析了MM组及健康对照组的血浆cf-DNA水平，并比较了两组cf-DNA的完整性差异。结果显示，MM组的ALU247和ALU115片段浓度及cf-DNA完整性均显著高于健康对照组，比较差异具有统计学意义(均P<0.05)。基于本研究的结果，cf-DNA有可能成为MM早期辅助诊断的有效指标。本研究进一步根据两组数据的cf-DNA含量及完整性结果做ROC曲线分析也提示，cf-DNA含量及完整性在MM诊断筛查上具有积极意义。

本研究对13例经过3个疗程规范诱导化疗的患者进行了随访，结果显示，治疗后的ALU247和ALU115片段浓度以及cf-DNA完整性均较治疗前明显降低(均P<0.05),这进一步证实了cf-DNA的含量及完整性能够提示机体肿瘤负荷状态，可以用来评估病情与预测预后，这与Salvianti等[19]在甲状腺癌患者中的研究结果是一致的。

本研究结果显示，cf-DNA的完整性与血清M蛋白及骨髓异常浆细胞比例间均存在显著正相关关系，表明cf-DNA的含量及完整性可能成为患者病情评估和疗效评价的指标，可以协同或者替代血清M蛋白含量及骨髓异常浆细胞比例评估患者的病情、疗效及预后。

本研究从小样本临床研究出发，证实了cf-DNA水平在初诊MM患者与健康人之间存在统计学差异，提示cf-DNA有望成为MM筛查的一个重要指标。本研究亦有不足之处：本研究纳入的样本总量较小，为使实验结果更加具有普遍性，后期研究仍需收集更多的样本；同时，由于本研究随访患者数较少，且随访周期较短，对于cf-DNA在疾病的治疗监测及预后等方面作用的结论有待扩充，应该对患者进行长期的随访，以进一步明确cf-DNA的水平变化在MM诊断、临床疗效及预后评估等疾病管理中的作用。

随着精准医学时代的到来，大量临床研究表明循环肿瘤细胞、cf-DNA、循环肿瘤DNA等新型标志物在肿瘤诊断及疗效评估中具有巨大潜力。然而，目前仍缺乏规范的、统一的质量控制标准，各实验室检测方法的差异、缺乏循证医学证据的指导等导致现有研究在分析cf-DNA浓度和肿瘤源性cf-DNA片段比例方面存在许多差异和矛盾的数据[20-21]。期待未来能开发出一种新方法，可以使不同来源的cf-DNA差异化富集。这些环节的完善将进一步推动cf-DNA在MM的诊断与疗效评估中的应用。

文章来源:张岚鑫,蒋艺枝,邱丽君,等.多发性骨髓瘤血浆循环游离DNA定量检测和完整性分析[J].中国实验血液学杂志,2024,32(04):1106-1111.