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YKL-40、RSK4、cyclinD1在结肠癌中的表达及意义

2021-09-25 64 上传者：管理员

摘要：目的探讨人软骨糖蛋白(YKL)-40、核糖体S6蛋白激酶(RSK)4、细胞周期蛋白(cyclin)D1在结肠癌中的表达及意义。方法采用实时荧光定量聚合酶链反应(qRT-PCR)检测86例结肠癌患者血清中YKL-40、cyclinD1、RSK4mRNA表达水平;采用免疫组织化学法检测结肠癌组织及癌旁组织中YKL-40、cyclinD1、RSK4蛋白的表达情况。采用Pearson法分析结肠癌患者血清YKL-40、RSK4、cyclinD1表达水平的相关性,应用受试者工作特征(ROC)曲线分析其对结肠癌的诊断价值。分析YKL-40、RSK4、cyclinD1表达与结肠癌患者临床病理特征的关系。所有患者随访3年,采用Kaplan-Meier法分析YKL-40、RSK4、cyclinD1表达与患者预后的关系。采用COX比例风险回归多因素分析影响结肠癌患者预后的独立危险因素。结果与对照组相比,结肠癌组织及血清中YKL-40、cyclinD1的表达水平及蛋白阳性表达率显著升高(P<0.05),而RSK4的表达水平及蛋白阳性表达率显著降低(P<0.05);结肠癌中RSK4与YKL-40的表达呈负相关(P<0.05),RSK4与cyclinD1的表达呈负相关(P<0.05),YKL-40与cyclinD1的表达呈正相关(P<0.05);联合检测结肠癌的敏感性为94.19%,特异性为98.21%,AUC面积为0.985(95%CI:0.949～0.998);YKL-40、cyclinD1、RSK4表达与浸润深度、淋巴结转移、血管浸润、TNM分期、分化程度密切相关(P<0.05);YKL-40、cyclinD1阴性表达组总生存期(OS)分别高于阳性表达组(P<0.05),RSK4阳性表达组OS高于阴性表达组(P<0.05);COX分析显示淋巴结转移、TNM分期与YKL-40、RSK4、cyclinD1的异常表达是影响结肠癌患者预后的独立危险因素(P<0.05)。结论YKL-40、RSK4、cyclinD1在结肠癌中存在异常表达,且三者之间可能存在相互调控关系。

关键词：
人软骨糖蛋白(YKL)-40
核糖体S6蛋白激酶(RSK)4
细胞周期蛋白(cyclin)D1
结肠癌
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结肠癌属于消化系统肿瘤中常见恶性肿瘤之一，由于结肠癌早期症状不明显导致患者治疗效果较差，但结肠癌致病机制尚未完全阐明[1,2]。血清肿瘤标志物具有高效、简便、无创等优点，因而基于结肠癌的分子机制探寻结肠癌早期诊断及预后的分子标志物具有重要意义。人软骨糖蛋白(YKL)-40在结肠癌组织中的表达水平显著升高，其高表达量可能与结肠癌发生及发展密切相关[3]。细胞周期蛋白(cyclin)D1在结肠癌组织中的表达水平明显升高，其高表达量与患者临床分期、淋巴结转移等临床病理特征有关[4]。核糖体S6蛋白激酶(RSK)4蛋白在结直肠癌组织中阳性表达率显著降低，并可能发挥抑癌基因作用[5]。但YKL-40、RSK4、cyclinD1在结肠癌患者血清中的表达水平及其与患者预后的相关性研究相对较少。本研究通过观察结肠癌患者血清及癌组织中YKL-40、RSK4、cyclinD1表达水平并分析其相关性，分析其表达与患者临床病理特征及预后的关系，进一步探讨其对结肠癌的诊断价值，为结肠癌的早期诊断、治疗及预后评估提供依据。

1、资料与方法

1.1一般资料

收集2015年3月至2016年3月于萍乡市第二人民医院进行治疗的86例结肠癌患者为研究对象，所有患者经病理证实为结肠癌，男56例，女30例，平均年龄(60.12±7.32)岁。收集所有患者临床病理参数，35例无转移，51例有转移；临床分期Ⅰ～Ⅱ期35例，Ⅲ～Ⅳ期51例；分化程度：高分化26例，中分化21例，低分化39例；左半结肠43例，右半结肠43例。同时选取于萍乡市第二人民医院健康体检志愿者56例为对照组，男36例，女20例，平均年龄(62.11±6.09)岁。两组性别、年龄差异无统计学意义(P>0.05),具有可比性。所有结肠癌患者于术中切取结肠癌组织及其相应癌旁组织(≥5cm),术后置于-80℃超低温冰箱保存。纳入标准：结肠癌患者均经过手术病理证实；术前未接受放化疗。排除标准：合并其他恶性肿瘤；心、肝等重要器官严重损伤；生存期不超过6个月；临床资料不完整者。本研究经医院伦理委员会批准，所有患者知情且签署同意书。

1.2方法

1.2.1主要试剂与仪器

兔抗人YKL-40、RSK4、cyclinD1单克隆单抗购自美国Sigma公司；辣根过氧化物酶(HRP)标记山羊抗兔IgG购自于美国R&D公司；YKL-40、RSK4、cyclinD1引物由上海生工生物工程股份有限公司合成；RNA提取试剂盒购自北京生化科技有限公司；反转录试剂盒与实时荧光定量聚合酶链式反应(qRT-PCR)试剂盒购自美国Thermoscientific公司；二氨基联苯胺(DAB)显色剂购自北京索莱宝科技有限公司；免疫组化试剂盒购自福州迈新生物技术开发公司。BX51光学显微镜购自日本奥林巴斯公司；ABI7500型荧光定量PCR仪购自美国ABI公司。

1.2.2qRT-PCR检测结肠癌患者血清中YKL-40、RSK4、cyclinD1mRNA表达水平

所有患者术前2d抽取空腹静脉血3ml置于不含抗凝剂的试管内，4℃条件下经3000r/min转速离心15min,吸取上清液，置于4℃冰箱内保存待测。采用Trizol法从血清中提取RNA,核酸测定仪测定RNA含量，根据反转录试剂盒将RNA反转录为cDNA。YKL-40引物序列为：上游：5'-GAGGATGGAACTTTGGGTCTC-3',下游：5'-TCATTTCCTTGATTAGGGTGGT-3';RSK4引物序列为：上游：5'-AATGCTACCATTCGCTCCTCA-3',下游：5'-TTACAGGCCAGTTGATGTTCGC-3';cyclinD1引物序列为：上游：5'-AGGAACAGAAGTGCGAGGAGG-3',下游：5'-GGATGGAGTTGTCGGTGTAGATG-3';β-actin引物序列为上游：5'-GCTCGTCGTCGACAACGGCTC-3',下游：5'-CAAACATGATCTGGGTCATCTCCTC-3'。qRT-PCR反应体系共20μl:SYBRPremixExTaqⅡ(2×)10μl,cDNA2μl,上下游引物各0.8μl,ROXReferenceDye(50×)0.4μl,ddH2O6μl;反应条件：95℃预变性3min;95℃30s、60℃20s,72℃30s,共35个循环；72℃延伸10min。YKL-40、RSK4、cyclinD1均以β-actin为内参，采用2-ΔΔCt法计算YKL-40、RSK4、cyclinD1mRNA表达水平。

1.2.3免疫组化染色检测结肠癌组织中YKL-40、RSK4、cyclinD1阳性表达率

制备结肠癌组织石蜡切片，经不同浓度乙醇脱水，置于柠檬酸盐溶液内，20min后采用磷酸盐缓冲液(PBS)清洗，滴加3%过氧化氢溶液，室温孵育25min,PBS清洗，滴加山羊血清(15min),加入YKL-40、RSK4、cyclinD1一抗，4℃孵育24h,PBS清洗，加入二抗，室温孵育2h,PBS清洗，滴加DAB显色液，苏木素复染，经不同浓度乙醇脱水，加入二甲苯，中性树脂封片，置于显微镜下进行观察。结果判定[6]:200倍显微镜下观察阳性染色细胞计算阳性细胞百分比，根据染色程度：未着色计为0分；浅黄色计为1分；棕黄色计为2分；棕褐色计为3分。按照阳性细胞数目：阳性细胞数目<10%计为0分；阳性细胞数目10%～30%计为1分；阳性细胞数目31%～60%计为2分；阳性细胞数目>60%计为3分。取两组计分之和，评分>2分地为阳性表达，≤2分计为阴性表达。

1.2.4随访

结肠癌患者进行3年随访，随访截止日期为2018年5月，随访方式：电话或门诊复查，统计患者总生存期(OS)即从随机开始至因任何原因引起死亡的时间。

1.3统计学方法

采用SPSS22.0软件行独立样本t检验、χ2检验、受试者工作特征(ROC)曲线、Pearson相关分析、多因素分析。

2、结果

2.1结肠癌患者血清中YKL-40、RSK4、cyclinD1mRNA表达水平比较

与对照组相比，结肠癌组血清中YKL-40、cyclinD1mRNA表达水平均显著升高(均P<0.001),而RSK4mRNA表达水平显著降低(P<0.001),见表1。

2.2结肠癌及癌旁组织中YKL-40、RSK4、cyclinD1阳性表达率比较

免疫组化组显示YKL-40、cyclinD1、RSK4染色呈黄色、棕黄色、褐色，见图1。与癌旁组织相比，结肠癌组织YKL-40、cyclinD1蛋白阳性表达率显著增强(P<0.05),RSK4蛋白阳性表达率显著减弱(P<0.05),见表2。

2.3YKL-40、RSK4、cyclinD1在结肠癌中的表达相关性分析

RSK4表达与YKL-40表达呈负相关(r=-0.333,P=0.002),RSK4表达与cyclinD1表达呈负相关(r=-0.309,P=0.004),YKL-40表达与cyclinD1表达呈正相关(r=0.224,P=0.038),见图2。

2.4YKL-40、RSK4、cyclinD1联合检测对结肠癌的诊断价值分析

ROC分析YKL-40、RSK4、cyclinD1对结肠癌的诊断价值，YKL-40表达水平诊断结肠癌的敏感性为62.79%,特异性为57.14%,曲线下面积(AUC)面积为0.783(95%CI:0.706～0.848);RSK4表达水平诊断结肠癌的敏感性为41.86%,特异性为89.29%,AUC面积为0.605(95%CI:0.520～0.686);cyclinD1表达水平诊断结肠癌的敏感性为54.65%,特异性为69.64%,AUC面积为0.690(95%CI:0.607～0.765);联合检测诊断结肠癌的敏感性为94.19%,特异性为98.21%,AUC面积为0.985(95%CI:0.949～0.998),联合检测诊断敏感性显著高于单项检测(P<0.05),见图3。

2.5YKL-40、RSK4、cyclinD1表达与结肠癌患者临床病理特征的相关性

YKL-40阳性表达、cyclinD1阳性表达、RSK4阳性表达与浸润深度、淋巴结转移、血管浸润、TNM分期、分化程度相关(P<0.05),而与年龄、性别、肿瘤位置、病理分型、肿瘤直径、病理类型无相关性(P>0.05),见表3。

2.6YKL-40、RSK4、cyclinD1表达与结肠癌患者预后的相关性分析

Kaplan-Meier曲线显示，YKL-40、RSK4、cyclinD1均与患者OS密切相关。YKL-40阴性表达组生存率(40.23%)高于阳性表达组(19.88%),cyclinD1阴性表达组生存率(51.28%)高于阳性表达组(18.76%),RSK4阳性表达组生存率(43.56%)高于阴性表达组(18.83%),差异均有统计学意义(均P<0.05),见图4。

2.7影响结肠癌患者预后的Cox回归分析

将影响结肠癌患者预后的因素进行COX比例风险回归多因素分析，以浸润深度、淋巴结转移、血管浸润、TNM分期、分化程度、YKL-40表达、RSK4表达、cyclinD1表达为自变量进行分析，结果显示淋巴结转移、TNM分期、YKL-40表达、RSK4表达、cyclinD1表达是影响结肠癌患者预后的独立危险因素(P<0.05),见表4。

3、讨论

据调查显示，近年来，结肠癌发病率逐年增加，随着现代分子生物学及基因检测的发展，越来越多的肿瘤标志物与治疗靶点的发现成为提高结肠癌患者生存率的重点研究方向[7]。但结肠癌早期筛查指标的灵敏度及特异度较低导致其诊断效率降低[8]。结肠癌发病机制较为复杂，研究表明基因表达异常可促进结肠癌细胞分化或促进癌症发生发展[9]。因此本研究拟探寻结肠癌早期诊断及其预后的独立预测因子。

YKL-40在卵巢癌等肿瘤组织中呈高表达，并可作为评估患者预后的分子标志物[10]。研究表明子宫内膜癌组织及血清中YKL-40的表达水平明显升高，并可作为早期诊断子宫内膜癌的重要辅助标志物[11]。乳腺癌患者血清中YKL-40的表达水平升高，其高表达量与患者淋巴结转移密切相关，并可作为判断乳腺癌患者预后的预测因子[12]。与上述研究报道相似，本研究结果提示YKL-40表达水平升高可能促进结肠癌的发生。研究表明cyclinD1在肺癌组织中呈高表达，并可作为评估肺癌患者预后的参考指标[13]。结肠癌发生发展与细胞周期失控有关，研究表明cyclinD1在肿瘤组织中呈高表达，其表达量升高可促进细胞周期进展，抑制cyclinD1的表达可降低细胞增殖能力[14,15]。本研究结果提示cyclinD1表达水平升高可能促进结肠癌的发生，YKL-40可能正向调控cyclinD1表达参与结肠癌的发生过程。

RSK4在胰腺癌等多种恶性肿瘤中表达下调，并可参与肿瘤细胞凋亡、迁移及侵袭等过程[16,17]。研究表明RSK4还可通过调控细胞周期影响肿瘤细胞增殖及分化[18,19]。相关报道指出RSK4在乳腺癌组织中表达水平降低，并可影响乳腺癌发生发展过程[20,21]。本研究结果提示，YKL-40、cyclinD1在结肠癌中呈高表达，RSK4表达降低，RSK4与YKL-40、cyclinD1在结肠癌中的表达呈负相关，而YKL-40与cyclinD1在结肠癌中的表达呈正相关，YKL-40、cyclinD1、RSK4表达水平与结肠癌患者淋巴结转移、TNM分期等临床病理特征密切相关，并可作为评估患者预后的重要指标，联合检测血清YKL-40、cyclinD1、RSK4表达水平可提高结肠癌诊断效率，可为结肠癌的发病机制及临床诊断提供参考依据。但结肠癌中YKL-40、cyclinD1、RSK4之间是否存在转录调控作用还需进一步研究验证。