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党参炔苷对卵巢癌细胞恶性生物学行为的影响

2025-03-12 8 上传者：管理员

摘要：目的探究党参炔苷(LT)调节RhoA/Rho相关卷曲螺旋形成蛋白激酶(ROCK)信号通路对卵巢癌细胞恶性生物学行为的影响。方法以A2780细胞为研究对象分为A2780组(未处理)、L-LT组(10μmol/L LT孵育A2780细胞)、M-LT组(20μmol/L LT孵育A2780细胞)、H-LT组(40μmol/L LT孵育A2780细胞)、H-LT+LPA组[40μmol/L LT及5μmol/L RhoA/ROCK信号通路激活剂(LPA)共同处理A2780细胞];Western印迹检测RhoA/ROCK通路及上皮间质转化(EMT)蛋白表达；CCK-8法检测A2780细胞增殖；流式细胞术测量细胞凋亡；Transwell法测量细胞侵袭和迁移；建立异种移植肿瘤模型，称量肿瘤质量，计算肿瘤体积。结果与人正常卵巢上皮细胞系(IOSE-80)细胞相比，A2780细胞中RhoA、ROCK2蛋白表达显著上调(P<0.05);与A2780组相比，L-LT组、M-LT组、H-LT组A2780细胞光密度(OD)值、迁移细胞数量、侵袭细胞数量、N-钙黏蛋白(cadherin)、波形蛋白(vimentin)、p-RhoA/RhoA、p-ROCK2/ROCK2、p-LIM激酶(LIMK)/LIMK蛋白表达、肿瘤体积、肿瘤质量随LT剂量的增加逐渐明显降低，细胞凋亡率、E-cadherin蛋白表达逐渐明显上升(P<0.05);与H-LT组相比，H-LT+LPA组OD值、迁移和侵袭细胞数量、N-cadherin、vimentin、p-RhoA/RhoA、p-ROCK2/ROCK2、p-LIMK/LIMK蛋白表达、肿瘤体积、肿瘤质量显著上升，细胞凋亡率、E-cadherin蛋白水平显著下降(P<0.05)。结论 LT可能通过下调RhoA/ROCK信号通路促进A2780细胞凋亡，抑制迁移、侵袭、增殖和EMT。

关键词：
RhoA/相关卷曲螺旋形成蛋白激酶(ROCK)信号通路
上皮间质转化
党参炔苷
卵巢癌
生物标志物
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卵巢癌是女性最常见的恶性肿瘤疾病,由于早期无明显症状,且缺乏可靠的筛查方法和特定的生物标志物,其死亡率极高〔1〕｡据报道,Ⅰ期卵巢癌患者的5年生存率大于90%,但晚期疾病患者的5年生存率仅为29%〔2〕｡因此,有必要探索卵巢癌的发病机制,以改善预后｡Ras同源基因家族成员(Rho)是一种小型的鸟苷结合蛋白,Rho相关卷曲螺旋形成蛋白激酶(ROCK)是RhoA激活下游通路的调控基因｡研究报道称,RhoA､ROCK在卵巢癌中上调,并通过不同的机制参与细胞迁移､生长和存活〔3〕｡Wang等〔4〕发现,激活RhoA/ROCK信号通路诱导卵巢癌细胞发生侵袭和迁移,可能加快卵巢癌恶性进展｡故推测RhoA/ROCK信号通路是卵巢癌发展的关键通路｡党参炔苷(LT)是党参的主要活性成分,具有抗癌､抗菌､镇静､抗炎､降压作用｡研究发现,LT对癌症的治疗起到积极效果,如He等〔5〕发现,LT可以通过抑制谷氨酰胺代谢诱导结肠癌细胞凋亡｡有研究〔6〕也发现,LT可以诱导乳腺癌细胞凋亡,抑制细胞增殖,进而发挥抗癌作用｡乳腺癌与卵巢癌关系密切,乳腺癌患者患卵巢癌的概率要远远高于一般人群〔7〕｡LT已被证实对乳腺癌的治疗起积极效果,但关于LT在卵巢癌上的研究还尚未见报道,本研究探讨LT通过调节RhoA/ROCK信号通路对卵巢癌细胞恶性生物学行为的影响｡

1、材料与方法

1.1细胞株及主要材料人卵巢癌细胞系A2780细胞(货号:MC⁃H8353)和人正常卵巢上皮细胞系IOSE⁃80细胞(货号:MC⁃H7453)购自上海名劲生物科技有限公司;LT(货号:YG10275)上海韵泰信息科技有限公司;RhoA/ROCK信号通路激活剂⁃溶血磷脂酸(LPA),深圳市健竹科技有限公司(货号:30113230);CCK⁃8细胞增殖试剂盒(货号:FS⁃79071),上海抚生实业;膜联蛋白Ⅴ⁃异硫氰酸荧光素/碘化丙啶(AnnexinⅤ⁃FITC/PI)细胞凋亡检测试剂盒(货号:E⁃CK⁃A211),武汉伊莱瑞特;E⁃钙黏蛋白(cadherin)一抗(货号:ab76319)､波形蛋白(vi⁃mentin)一抗(货号:ab8978)､N⁃cadherin一抗(货号:ab245117)､RhoA一抗(货号:ab187027)､ROCK2一抗(货号:ab125025)均购自Abcam｡

1.2细胞培养及分组将A2780细胞和IOSE⁃80细胞均接种于含有10%胎牛血清､1%青霉素､1%链霉素的RPMI1640培养基,在37℃下､5%的CO2培养箱进行培养｡实验分为:A2780组(未处理)､L⁃LT组(10μmol/LLT孵育A2780细胞)､M⁃LT组(20μmol/LLT孵育A2780细胞)､H⁃LT组(40μmol/LLT孵育A2780细胞)〔5〕､H⁃LT+LPA组(40μmol/LLT及5μmol/LRhoA/ROCK信号通路激活剂LPA共同干预A2780细胞〔8〕)｡细胞处理时长均为24h｡

1.3Western印迹测上皮间质转化(EMT)及RhoA､ROCK2蛋白表达用放射免疫沉淀(RIPA)裂解液提取A2780细胞蛋白｡定量后使用10%十二烷基硫酸钠⁃聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS⁃PAGE)分离蛋白,并转到聚偏氟乙烯(PVDF)膜上｡室温下用TBST(含5%脱脂奶粉)封闭膜2h后,一抗E⁃cad⁃herin(1∶500)､N⁃cadherin(1∶500)､vimentin(1∶500)､RhoA(1∶1000)､ROCK2(1∶1000)和GAPDH(1∶1000),4℃过夜孵育;添加二抗,37℃孵育120min｡电化学发光(ECL)试剂显影,ImageJ软件用于分析条带灰度值｡

1.4CCK⁃8法测量细胞增殖A2780细胞接种在96孔板(5000个/孔)中｡48h后,各添加CCK⁃8溶液10μl｡37℃孵育2h｡用酶标仪记录450nm下的吸光度(OD)值｡

1.5流式细胞术分析细胞凋亡A2780细胞在胰蛋白酶中消化,冷磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤,重悬后添加AnnexinⅤ⁃FITC和PI溶液各5μl,避光孵育15min｡流式细胞仪测量细胞凋亡率｡

1.6Transwell法分析侵袭和细胞迁移为了进行细胞迁移,将2000个细胞接种到Transwell小室的上室中,并加入200μl无血清的RPMI1640培养基｡在下腔室中加入600μl含有10%胎牛血清(FBS)的RPMI1640培养基｡在37℃下培养24h后,用棉签轻轻擦拭每个上部腔室的表面｡在室温下用4%多聚甲醛固定30min,并用结晶紫染色30min｡然后在显微镜下计数浸润下腔表面滤膜的细胞｡对于细胞侵袭,将Transwell室的上室预铺满基质胶,其他步骤与细胞迁移实验一致｡

1.7异种移植肿瘤模型从济南朋悦实验动物繁育有限公司购买20只雌性裸鼠(6~8周龄;体质量20~25g),生产许可证号:SCXK(鲁)20190003｡裸鼠被安置在(25±1)℃环境下,12h光/暗循环,(50±5)%的湿度,自由获得食物和水｡将悬浮在0.5mlPBS中的A2780细胞(2×106个)注射到每只裸鼠的右侧腋窝皮下｡将注射A2780细胞的裸鼠随机分为5组各10只:A2780组(未处理)､L⁃LT组(10mg/kgLT)､M⁃LT组(20mg/kgLT)､H⁃LT组(40mg/kgLT)〔5〕､H⁃LT+LPA组(40mg/kgLT+25μmol/LLPA〔9〕),1次/d,连续腹腔注射2w,在注射后第15天处死所有裸鼠,并取出裸鼠的肿瘤并称重｡根据公式〔体积=(肿瘤长度×肿瘤宽度2)/2〕计算肿瘤体积｡

1.8统计学分析采用SPSS25.0软件进行t检验､单因素方差分析和SNK⁃q检验｡

2、结果

2.1A2780细胞和IOSE⁃80细胞中RhoA､ROCK蛋白表达与IOSE⁃80细胞相比,A2780细胞中RhoA､ROCK2蛋白表达显著上调(P<0.05),见图1､表1｡

图1Western印迹检测A2780和IOSE⁃80细胞RhoA､ROCK2蛋白表达

表1A2780和IDSE⁃80细胞中RhoA､ROCK2蛋白表达(x±s,n=6)

2.2LT对A2780细胞RhoA/ROCK通路相关蛋白表达的影响与A2780组相比,L⁃LT组､M⁃LT组､H⁃LT组p⁃RhoA/RhoA､p⁃ROCK2/ROCK2､p⁃LIM激酶(LIMK)/LIMK蛋白表达下调,差异显著(P<0.05);与L⁃LT组相比,M⁃LT组､H⁃LT组p⁃RhoA/RhoA､p⁃ROCK2/ROCK2､p⁃LIMK/LIMK蛋白表达降低,差异显著(P<0.05);相比M⁃LT组,H⁃LT组p⁃RhoA/RhoA､p⁃ROCK2/ROCK2､p⁃LIMK/LIMK蛋白表达下降,差异显著(P<0.05);相比H⁃LT组,H⁃LT+LPA组p⁃RhoA/RhoA､p⁃ROCK2/ROCK2､p⁃LIMK/LIMK蛋白表达增加,差异显著(P<0.05),见表2､图2｡

表2LT对A2780细胞RhoA/ROCK通路相关蛋白表达及细胞迁移和侵袭的影响(x±s,n=6)组别p⁃RhoA/RhoAp⁃ROCK2/ROCK2p⁃LIMK/LIMK侵袭细胞数(个)迁移细

2.3LT对A2780细胞迁移及侵袭能力的影响与A2780组相比,L⁃LT组､M⁃LT组､H⁃LT组A2780细胞迁移细胞数量､侵袭细胞数量依次降低,差异显著(P<0.05);与H⁃LT组相比,H⁃LT+LPA组A2780细胞迁移细胞数量､侵袭细胞数量上升,差异显著(P<0.05),见表2､图3｡

图3各组A2780细胞迁移和侵袭(结晶紫染色,×200)

2.4LT对A2780细胞EMT相关蛋白表达的影响与A2780组相比,L⁃LT组､M⁃LT组､H⁃LT组的A2780细胞N⁃cadherin､vimentin蛋白表达明显下降,E⁃cadherin蛋白表达明显上升,且呈明显剂量依赖性(P<0.05);相比H⁃LT组,H⁃LT+LPA组N⁃cad⁃herin､vimentin蛋白表达明显上升,E⁃cadherin蛋白表达明显下降(P<0.05),见图2､表3｡

图2Western印迹检测各组RhoA/ROCK通路及EMT相关蛋白表达

2.5LT对A2780细胞凋亡的影响与A2780组A2780细胞凋亡率〔(5.54±0.05)%〕相比,L⁃LT组〔(15.31±2.24)%〕､M⁃LT组〔(23.46±3.57)%〕､H⁃LT组A2780细胞凋亡率〔(36.23±6.26)%〕逐渐明显上升(P<0.05);相比H⁃LT组,H⁃LT+LPA组细胞凋亡率〔(9.82±1.42)%〕明显降低(P<0.05),见图4｡

图4流式细胞术检测各组A2780细胞凋亡

2.6LT对A2780细胞增殖能力的影响与A2780组A2780细胞OD值(1.53±0.20)相比,L⁃LT组(1.21±0.13)､M⁃LT组(0.95±0.10)､H⁃LT组A2780细胞OD值(0.61±0.05)随LT剂量增加逐渐明显降低(P<0.05);与H⁃LT组相比,H⁃LT+LPA组A2780细胞OD值(1.46±0.15)显著升高(P<0.05)｡

2.7LT对肿瘤体积和肿瘤质量的影响相比A2780组,L⁃LT组､M⁃LT组､H⁃LT组肿瘤体积､肿瘤质量逐渐明显下降(P<0.05);相比H⁃LT组,H⁃LT+LPA组肿瘤体积､肿瘤质量显著上升(P<0.05),见表3､图5｡

表3LT对A2780细胞EMT相关蛋白及肿瘤体积和肿瘤质量的影响(x±s,n=6)

图5各组裸鼠移植瘤

3、讨论

70%的卵巢癌患者在早期诊断时出现腹膜转移〔10〕｡尽管近年来卵巢癌的治疗取得了很大进展,但治疗药物的耐药性和副作用使治疗药物的作用效果非常有限〔11〕｡因此,迫切需要寻找新的抗肿瘤药物｡LT是一种聚乙炔糖苷,存在于各种药用植物中,但主要从党参的根部分离出来,它通常用于补脾和补肺气,偶尔用于治疗癌症〔12〕｡有报道〔13〕称,LT可以诱导人肺腺癌细胞凋亡及改善肺生态失调｡Sun等〔14〕报道称,LT可以有效减弱胃癌细胞的增殖､迁移和侵袭｡Chen等〔7〕也发现,LT可以诱导乳腺癌细胞凋亡,抑制其增殖,发挥抗癌效果｡乳腺癌和卵巢癌均与内分泌有关,乳腺癌是继发性卵巢癌最常见的原发性起源之一〔15〕｡细胞增殖与凋亡是癌细胞发展的典型特征〔16〕｡本研究结果表明,LT可能通过抑制A2780细胞增殖､诱导A2780细胞凋亡来抑制卵巢癌的恶性生物学行为,且在本研究使用的剂量范围内,剂量越高,作用效果越好｡

迁移和侵袭是早期癌症进展为晚期的主要特征之一,也是癌症患者复发和死亡的关键原因｡研究表明,阻碍细胞侵袭和侵袭可抑制卵巢癌进展〔17〕｡在EMT过程中,肿瘤细胞中细胞黏附分子表达逐渐减少,并获得间充质表型及迁移和侵袭能力,使癌细胞脱离原发肿瘤并在其他地方形成转移瘤〔18〕｡EMT的特征在于E⁃cadherin等上皮细胞标志物缺失,N⁃cadherin､vimentin等间充质细胞标志物表达上调｡本研究结果表明,LT可能通过阻止A2780细胞EMT进程,抑制卵巢癌的进展｡

RhoA/ROCK信号通路在卵巢癌上的研究已有大量报道,如Sarwar等〔19〕发现,可以通过抑制RhoA/ROCK信号传导对卵巢癌的发展起到抑制作用｡Wei等〔20〕发现,激活RhoA/ROCK信号通路可以促进卵巢癌细胞的转移｡Sui等〔21〕也发现,抑制RhoA/ROCK信号通路可以抑制卵巢癌细胞生长及细胞迁移,进而阻止卵巢癌发展｡上述研究均提示,RhoA/ROCK信号通路可能是治疗卵巢癌的靶向通路｡本研究结果表明,LT可能通过抑制RhoA/ROCK信号通路发挥诱导A2780细胞凋亡､抑制A2780细胞增殖､迁移和侵袭的作用｡LT的抗卵巢癌作用可能是通过阻滞RhoA/ROCK通路实现的｡且LT使A2780细胞移植瘤裸鼠肿瘤体积､肿瘤质量显著下降,LPA消除LT对移植瘤裸鼠的有利影响,进一步证实该结论｡

综上,LT可能通过抑制RhoA/ROCK通路阻滞A2780细胞迁移､增殖､侵袭和EMT,诱导凋亡,进而减缓卵巢癌进展｡本研究不足之处在于体内实验较少,需要后续在裸鼠上进一步证实LT可能通过下调RhoA/ROCK通路阻止卵巢癌的发展｡

参考文献:

9于倩,安喆妮.黄芪甲苷通过RhoA/ROCK2通路对脑膜炎大鼠皮质神经元的保护作用〔J〕.中医药导报,2021;27(11):12⁃7

基金资助:徐州医科大学附属医院发展基金资助项目(XYFY2020055);

文章来源:丁佰娟,王稳,李南.党参炔苷对卵巢癌细胞恶性生物学行为的影响[J].中国老年学杂志,2025,45(05):1224-1228.