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miR-1251-3p负调控HE4抑制卵巢癌细胞株COC1的增殖和侵袭

2020-09-23 151 上传者：管理员

摘要：目的:探讨miR1251-3p负调控HE4对卵巢癌细胞株COC1的增殖和侵袭的影响。方法:实验分为空白组、阴性对照组、模拟物组(mimic)和抑制剂组(inhibitor)。采用qPCR、划痕实验和Transwell小室实验,检测miR-1251-3p在卵巢癌细胞株COC1细胞株侵袭转移中的作用。结果:miR-1251-3p与HE4的3’UTR区域有结合位点。与卵巢癌细胞株COC1空白组和阴性对照相比,转染miR-1251-3pmimics会抑制增殖和侵袭,而转染miR-1251-3pinhibitor可以促进卵巢癌细胞COC1的增殖和侵袭。结论:miR-1251-3p负调控HE4抑制卵巢癌细胞株COC1的增殖和侵袭。

关键词：
HE4
miR-1251-5p
侵袭
卵巢癌
增殖
细胞株
结合位点
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女性一生罹患卵巢癌的一生风险是75分之一,而死于该疾病的几率是百分之一。卵巢癌通常出现在晚期,而5年相对存活率仅为29%。令人遗憾的是,自1995年以来,全球卵巢癌的总体5年相对生存率在30%～40%之间,仅出现了很小的增长(2%～4%)[1,2]。因此,找到卵巢癌侵袭和转移的分子标记和靶点,则有望为早期诊断及治疗卵巢癌细胞提供理论依据。

微小RNA(miRNA)是由19～25个核苷酸组成的小型非编码RNA簇,在过去的十年中,在致癌作用中已成为癌基因或抑癌基。针对超过60%的人类编码基因,miRNA可以调节几乎所有生物过程,包括人类的细胞增殖,细胞周期和炎症,主要通过其下游靶基因调控肿瘤的发生发展[3,4]。最近有文献报道microRNA-1251-5p通过靶向卵巢癌细胞中的肿瘤抑制物TBCC促进癌变和自噬。miR-1251-5p位于染色12q23.1上,迄今为止,没有太多报道关注此miRNA的研究。miRNA的微阵列分析表明,胃癌细胞中miR-1251-5p的表达低于正常细胞。在透明细胞肾细胞中,miR-1251-5p的表达也下调[5]。但是,在卵巢癌中miR-1251-3p的影响并不明确,而且miR-1251-3p的生物学功能在不同的癌症中是多样化的。在当前研究中,我们证实了miR-1251在卵巢癌细胞系中上调。miR-1251-5p通过靶向HE4影响细胞迁移与增殖,对肿瘤起到抑制作用。

1、资料与方法

1.1卵巢癌细胞株COC1购自美国ATCC公司。

1.2主要试剂DMEM高糖培养基购自Hyclone公司,胎牛血清购杭州四季青公司,二甲基亚砜DMSO冻存液购自美国sigma公司。逆转录及荧光定量PCR试剂盒购自TaKaRa生物技术公司,miRNAmimic及inhibitor购自上海吉玛技术有限公司。

1.3方法实验分为空白组,阴性对照组(转染阴性对照negativecontrol),mimics组和inhibitor组(即转染miR-1251-3pmimics和inhibitor组)。

1.3.1实时荧光定量PCR利用Trizol法从卵巢癌细胞株COC1中提取总RNA,测量浓度计纯度,按照TaKaRa公司逆转录试剂盒说明书进行逆转录,进一步根据荧光定量PCR试剂盒说明书进行定量PCR测定。

1.3.2细胞蛋白样品的制备培养瓶中的细胞经过裂解,离心。取上清。采用BCA法测定蛋白浓度。加入5×SDS加样缓冲液,100℃加热10min后,-20℃保存。

1.3.3蛋白浓度测定采用碧云天公司的BCA蛋白浓度测定试剂盒说明书进行。样品制备完毕后采用酶标仪测定,其测定波长540nm的吸光度。根据标准曲线计算蛋白浓度。

1.3.4转染培养生长状态良好的细胞,转染前一天将目的细胞分入6-well培养板培养,用于后续荧光定量PCR实验用。按照miR-1251-3pmimic及inhibitor试剂说明书稀释干粉,为转染做好准备。培养24-72h收集细胞进行相关实验。

1.3.5划痕实验按照事先实验设计组别,在孔中加入约3*104个转染后的细胞。待细胞长满皿底,换低浓度血清培养基,将划痕仪对准12孔板的下端中央部位,朝上轻推划痕。用PBS洗2遍,再加入低浓度血清培养基,拍照。放入37℃,5%CO2培养箱培养24h,取出后用显微镜拍照。

1.3.6体外细胞侵袭实验溶胶,之后用冷无血清DMEM稀释Matrigel胶(1:3稀释);接种培养细胞,孵育48小时;4%多聚甲醛固定tranwell小30mins,0.1%结晶紫染色tranwell小室30mins,小心擦去上室细胞,随机取3个视野计数,显微镜拍照。

1.4统计分析所有数据以均数±标准差表示,符合正态分布,SPSS.15.0统计软件包进行处理,各组间差异采用单因素方差one–wayANOVA分析,方差分析前进行方差齐性检验,多重比较采用LSD法。P<0.05为显著性差异。

2、结果

2.1人附睾蛋白4(HE4)在卵巢癌患者血清中的表达情况

采用化学发光酶联免疫方法,检测卵巢癌患者(A组,42例)、卵巢良性肿瘤患者(B组,51例)和健康志愿者(C组,32例)血清中HE4的表达情况。A、B组均经手术后病理学确诊。B、C组患者排除既往有肿瘤病史者,且无心、肺、肝、肾等重要脏器疾患,相关各种检查指标在正常范围内。实验结果显示健康志愿者的HE4表达为47.8±8.7pmol/L,而卵巢癌患者高达127.8±10.4pmol/L,已经充分说明,HE4作为卵巢癌的肿瘤标记物,可以应用于卵巢癌的早期诊断。

表1不同人群中人附睾蛋白4(HE4)的表达水平

2.2在卵巢癌细胞COC1中miR-1251-3p负调控HE4的表达

通过miRNA结合位点预测TargetScan(http://www.targetscan.org/vert＿71/),对HE4的3’UTR区域进行了miRNA的预测。结果显示在551-565之间存在miR-1251-3p的结合位点(图1)。然后通过转染miR-1251-3p的mimic和inhibitor干扰miR-1251-3p表达后,检测miR-1251-3p及HE4相应指标的变化。实验结果显示,与空白组COC1以及阴性对照COC1-NC组比较,转染mimic组HE4表达下调显著,miR-1251-3p表达显著上调;与空白组COC1以及阴性对照COC1-NC组比较,转染inhibitor组HE4表达上调显著,miR-1251-3p表达显著下调,结果见图2,表2。结果表明miRNA可以在卵巢癌细胞COC1中miR-1251-3p负调控HE4的表达。

图1miR-1251-3p与HE43’UTR结合区域

图2荧光定量PCR检测miR-1251-3p对卵巢癌细胞COC1的HE4的影响

表2荧光定量PCR检测miR-1251-3p对卵巢癌细胞COC1的HE4的影响

2.3miR-1251-3p抑制卵巢癌细胞COC1的迁移

为了观察miR-1251-3p表达对卵巢癌细胞COC1细胞株迁移行为的影响,我们进行了划痕实验。实验结果显示(图3):与空白组COC1以及阴性对照COC1-NC组比较,卵巢癌细胞株COC1培养48h后,转染inhibitor的细胞迁移能力增强明显;与空白组COC1以及阴性对照COC1-NC组比较,卵巢癌细胞株COC1培养48h后,转染mimics的组细胞迁移能力减弱明显。这表明miR-1251-3p能减弱卵巢癌细胞细胞的迁移能力。

图3划痕实验检测miR-1251-3p对卵巢癌细胞COC1的迁移的影响

2.4miR-1251-3p抑制卵巢癌细胞COC1的侵袭

为了观察miR-1251-3p表达对卵巢癌细胞COC1细胞株迁移行为的影响,我们转染miR-1251-3p的mimics和inhibitor,利用Transwell实验检测细胞侵袭的变化。实验结果显示(图4):与空白组COC1以及阴性对照COC1-NC组比较,卵巢癌细胞株COC1培养48h后,转染inhibitor的细胞侵袭能力增强明显;与空白组COC1以及阴性对照COC1-NC组比较,卵巢癌细胞株COC1培养48h后,转染mimics的组细胞侵袭能力减弱明显。这表明miR-1251-3p能减弱卵巢癌细胞细胞的侵袭能力。

图4荧光定量PCR检测miR-1251-3p对卵巢癌细胞COC1的侵袭的影响

3、讨论

这项研究表明,miR-1251-5p在卵巢癌细胞系中靶向调控HE4,并且与卵巢癌迁移和侵袭密切相关。

作为一种新型肿瘤标志物,人附睾蛋白4(HE4)定量检测产品的面世将有助于卵巢癌的早期诊断、治疗监测和预后评估,从而极大提高卵巢癌患者的存活率[6]。日前,用于卵巢癌诊断的Elec-sysHE4定量检测已在我国获批上市。可见HE4作为肿瘤的标记物显得日益重要,而且在卵巢癌中的作用日益明确。研究表明,人附睾蛋白4在卵巢癌细胞粘附和运动中起关键作用[7],HE4也可以促进卵巢癌细胞对顺铂和紫杉醇的附带耐药性[8]。但是并没有作为研究靶点,这一方面是HE4作为分泌蛋白有关,另一方面是其抑制剂并不明确。这就为我们深度探讨抑制HE4的作用机制提供了深刻要求。

miRNA是小(20-23nt)非编码,内源性,单链RNA调节基因表达在转录后水平。在多项研究中,各种miRNA在卵巢癌进展中被报告。miR-141通过在卵巢癌中靶向KLF12促进细胞增殖、肿瘤生长和抗阿诺基斯[9]。miR-141/KLF12/Sp1/Survivin在增强抗炎能力方面起着重要作用。miR-551b-3p对卵巢癌细胞对凋亡、生存和增殖的抵抗力,通过与STAT3.7的启动子的相互作用,刺激STAT3转录和表达[10]。本研究中我们通过对卵巢癌细胞COC1细胞株进行了转染miR-1251-3pmimics和inhibitor,对其生物学功能进行了研究,实验表明miR-1251-3p能减弱卵巢癌细胞细胞的迁移与侵袭能力。这为我们治疗卵巢癌提供了新的治疗靶点。

miR-125-3p可以抑制卵巢癌细胞的迁移与侵袭,但是具体机制我们并未探讨,这对miR-125-3p是如何影响卵巢癌至关重要。因此,进一步研究miR-125-3p在卵巢癌侵袭转移中的机制,为下一步探讨miR-125-3p相关作用靶点提供新的深度的理论依据。

参考文献：

[3]赵银龙,王洪冰,毛铁铸,等.microRNA与肿瘤关系的研究进展[J].癌症进展,2019,17(12):1365-1367,1384.

[4]李万春,涂频,周晓军.MicroRNA与卵巢癌[J].医学研究生学报(12):112-115.

[6]贺帅,马黎明,来艳君.HE4､CA125､SMRP检测联合ROMA在卵巢癌诊断中的应用[J].实用癌症杂志,2019,34(3):362-364,368.

[9]孙彩霞,宋藏珠,徐庆,等.卵巢癌组织和细胞株中miR-141表达水平与卡铂耐药性的关系[J].实用癌症杂志,2014(11):1364-1368.

李菲菲,邓庆梅,蔡云硕,计海芬.miR-1251-3p负调控HE4抑制卵巢癌细胞株COC1的增殖和侵袭[J].湖南师范大学学报(医学版),2020,17(04):31-33.

基金:安徽省自然科学基金项目(1708085MH204).