上皮性卵巢癌是临床上常见的恶性妇科肿瘤之一，其发病率仅次于宫颈癌及宫体癌[1],由于其发病隐匿及缺乏早期诊断指征，多数患者确诊时已处于晚期，不具有手术根治机会，具有较差预后[2]。目前上皮性卵巢癌标准治疗方案为手术联合化疗，且80%的该类患者对化疗药以铂类为基础的化疗敏感，但多数会发生化疗耐药或复发，90%以上患者死于原发性或继发性化疗耐药[3],因此探索有效的卵巢癌预防和早期诊断及化疗耐药预测特异性指标，对于化疗效果及预后尤为重要。近年来很多研究表明肿瘤的发生是多基因参与、多因素引起的恶性细胞性增殖，因此从基因水平探索肿瘤的发生发展机制对肿瘤的早期诊断及辅助化疗等方面具有至关重要的作用[4]。Kindlins属于包含FERM结构域的蛋白质家族，所有后生动物具有至少一个Kindlin基因。其中Kindlin2保留了Kindlins家族的祖先特征，属于黏附蛋白，在中胚层来源的组织中高表达，在细胞连接、调控细胞核功能及维持质膜形态等方面具有重要作用[5]。目前已有研究表明Kindlin2与前列腺癌[6]、乳腺癌[7]、胆囊癌[8]和急性髓系白血病[9]等的侵袭性、耐药性有关，但Kindlin2与卵巢癌的关系及对卵巢癌化疗耐药的影响鲜有研究报道。本研究重点探索了Kindlin2在上皮卵巢癌患者中的表达及对卵巢癌化疗耐药和临床预后的影响及作用机制，以期为临床诊断和治疗提供参考。

1、资料与方法

1.1一般资料

选取邢台市人民医院2013年1月至2015年6月经妇科手术术后病理检查明确诊断为上皮性卵巢癌的组织石蜡标本100例(由本院两位以上有经验病理科医师经过病理组织切片观察证实为上皮性卵巢癌患者的标本),年龄24～81岁，平均49.8岁，中位年龄50岁。纳入标准：(1)均为原发性上皮性卵巢癌；(2)术前均未接受放疗、化疗等治疗；(3)术后有意愿接受化疗，并能坚持以铂类和紫杉醇联合化疗者；(4)有完整的临床病理资料；(5)患者及家属知情同意此项研究并通过医院伦理审批同意。排除有其他恶性肿瘤病史者。按国际妇科联盟(FIGO 2016)标准进行临床病例分期；肿瘤组织学分级：G1+G2级41例，G3级59例。另选取行手术切除的良性卵巢浆液囊肿组织20例为良性卵巢病变组，正常卵巢组织取自因子宫肌瘤或子宫脱垂附件切除的患者20例为正常卵巢组。各组一般情况差异无统计学意义(P>0.05)。

1.2主要试剂

RNA提取试剂盒、动物组织蛋白提取、免疫组化、化学发光显色试剂盒均购自北京索莱宝科技有限公司；人抗Kindlin2单克隆抗体、人抗β-actin单克隆抗体、辣根过氧化物酶标记抗体购自Abcam[艾博抗(上海)贸易有限公司];逆转录试剂盒、实时荧光定量聚合酶链反应(PCR)试剂盒购自赛默飞世尔科技(中国)有限公司。

1.3免疫组化

采用免疫组化SP法对受试者卵巢组织中Kindlin2蛋白表达水平进行测定。将符合条件的受试者卵巢组织用石蜡包埋后用石蜡切片机切成厚度为4μm的薄片，将石蜡切片用甲苯脱蜡后再用梯度酒精水化，用3%过氧化氢(H2O2)室温孵育5～10 min,以消除内源性过氧化物酶的活性；用磷酸盐缓冲液(PBS)水洗3次，每次3 min,再用蒸馏水冲洗缓冲液；用一抗稀释液(兔抗人Kindlin2单克隆抗体美国abcam, 1∶100)封闭，室温孵育10 min,去血清后，滴加一抗工作液，4℃过夜孵育；PBS冲洗3次，每次3 min,滴加适量用生物素标记的二抗工作液，室温下孵育30 min, PBS冲洗3次，每次3 min;用配制的二氨基联苯胺(DAB)显色剂显色，自来水冲洗终止显色反应，苏木素复染2 min,用梯度酒精脱水、二甲苯透明后，再中性树胶封片，显微镜下观察显色结果。

1.4实时荧光定量PCR

用组织RNA提取试剂盒提取总RNA,超微量分光光度计测量RNA的浓度和纯度(纯度要求：A260/A280比值在2.0～2.2符合要求),用逆转录试剂盒将RNA逆转录成cDNA,以cDNA为模板进行PCR扩增。引物序列：Kindlin2上游5′-ATTCAGGCAGATGCTAAG-3′,下游5′-CCAGGAGTGATAAGAGGC-3′,磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)为内参基因[各引物于生工生物工程(上海)股份有限公司合成],PCR条件为：95℃30 s,预变性；95℃2 s、60℃20 s, 40个循环；60℃60 s。相对表达水平用2-ΔΔCt计算。

1.5 Western印迹检测蛋白表达

卵巢组织用组织蛋白提取试剂盒提取全蛋白后，采用二喹啉甲酸(BCA)法检测提取蛋白的浓度，利用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离等量蛋白(约30μg)后将蛋白转移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上，用5%脱脂奶粉室温封闭2 h后一抗(用5%脱脂奶粉1∶500稀释)4℃孵育过夜后PBS 15 min/3次洗膜后再用二抗室温下孵育2 h,加入显色剂曝光后，分析蛋白条带灰度值，GAPDH作为内参蛋白。

1.6疗效评价及随访

每6 w化疗完成后根据WHO肿瘤疗效评价标准[10]评定化疗疗效，分为完全缓解(CR)、部分缓解(PR)、稳定(SD)、 进展(PD)。总缓解率=(CR例数+PR例数)/总例数×100%。随访时间至2021年12月31日，观察EOC患者总生存期(OS,指手术开始至死亡或最终随访的时长)、无病生存期(DFS,指手术结束时到患者再次出现症状或有转移现象的时长)。

1.7构建稳定敲低Kindlin2细胞系

人卵巢癌细胞系SK0V3(购自美国ATCC公司),于10%胎牛血清的RPMI1640培养基进行培养，培养箱为95%饱和湿度、5%CO2。呈对数增长期的细胞被取用于实验。后利用shRNA干扰技术构建稳定敲低Kindlin2基因的SKOV3/shKindlin2细胞株及对照细胞株SKOV3/shCon。具体为接种适量SKOV3细胞于24孔板中，待细胞生长至60%～80%时将1 ml的shKindlin2慢病毒液和阴性对照的shCon分别加入24孔板SKOV3细胞中，分别标记为shKindlin2组和shCon组。于培养箱内进行48 h感染，后细胞被转至6孔板，进行细胞株稳定处理。

1.8卵巢癌细胞药物敏感性检测

取3×103个细胞接种于96孔板中，24 h后依次加入梯度浓度(0、3、6、9、12、15μmol/L)的含化疗药物顺铂(cDDP)的RPMI1640培养基。化疗作用48 h后，每孔加入20μl甲硫基磺酸盐(MTS)试剂，37℃继续孵育2.5 h,酶标仪测定吸光度(OD)值。计算各组细胞存活率，绘制细胞生长曲线图。

1.9统计学分析

采用SPSS22.0软件进行单因素方差分析和χ2检验。多因素分析采用Logistic回归分析，采用Kaplan-Meier进行生存期分析。

2、结 果

2.1 Kindlin2在卵巢组织中的表达

Kindlin2主要表达于细胞质中，呈黄色至棕黄色颗粒状。Ⅰ～Ⅱ期上皮性卵巢癌组Kindlin2表达率与Ⅲ～Ⅳ期上皮性卵巢癌组比较差异有统计学意义(P<0.05);在良性卵巢病变组、正常卵巢组中Kindlin2呈低表达或不表达，上皮性卵巢癌各组与其他两组Kindlin2表达率差异均有统计学意义(P<0.05,P<0.01)。见表1、图1。

2.2卵巢组织Kindlin2 mRNA的表达

荧光定量PCR结果显示，Ⅲ～Ⅳ期上皮性卵巢癌组Kindlin2 mRNA相对表达量显著高于其余3组(均P<0.05),良性卵巢病变组和正常卵巢组Kindlin2 mRNA相对表达量无显著性差异(P>0.05),这与免疫组化结果具有一致性。见表1。

表1各组组织类型、Kindlin2 mRNA、蛋白表达比较

图1不同类型卵巢组织中Kindlin2表达(HE染色，×200)   

2.3 Western印迹检测卵巢组织中Kindlin2蛋白表达

上皮性卵巢癌Kindlin2蛋白表达显著高于良性卵巢病变和正常卵巢(P<0.05),良性卵巢病变组和正常卵巢组Kindlin2变化无统计学差异(P>0.05)。见表1,图2。卵巢癌高(1.04±0.22,n=59)、中(2.51±0.25,n=16)、低(3.73±0.34,n=25)分化程度和临床分期Ⅰ(0.75±0.11,n=17)、Ⅱ(1.36±0.24,n=20)、Ⅲ(2.73±0.26,n=25)、Ⅳ(4.03±0.38,n=38)各组Kindlin2蛋白表达变化依次升高，差异均有统计学意义(P<0.05)。卵巢癌临床分期越高，其分化程度越低，Kindlin2表达水平越高，这与免疫组化和PCR检测检测结果具有一致性。见图2。

图2 Kindlin2在不同卵巢组织、不同分期及不同分化卵巢癌组织中表达  

2.4 Kindlin2蛋白表达与化疗效果及化疗耐药关系

Kindlin2阴性表达患者化疗有效率显著高于Kindlin2阳性患者，化疗耐药率显著低于Kindlin2阳性患者(P<0.001)。见表2。

2.5敲低Kindlin2增强卵巢癌细胞SKOV3化疗敏感性

相较于shCon组(1.08±0.24),shKindlin2组Kindlin2蛋白表达量(0.23±0.15)明显降低(P<0.05)。见图3。MTS法进行化疗敏感性检测，不同梯度浓度化疗药物处理的shKindlin2组细胞存活率显著低于shCon组(均P<0.05),表明敲低Kindlin2可有效增强卵巢癌细胞化疗敏感性。见表3。

表2 Kindlin2蛋白表达与化疗效果及化疗耐药关系[n(%)]

图3 Western印迹检测敲低Kindlin2效率  

表3不同浓度化疗药物下卵巢癌细胞化疗敏感度(%)

2.6 Kindlin2蛋白表达与卵巢癌临床病理特征的相关性

Kindlin2阳性表达患者在不同肿瘤最大直径、浸润深度、淋巴结转移、复发性、病理学分级差异显著(P<0.001)。化疗耐药性在不同肿瘤最大直径、浸润深度、淋巴结转移、复发性及病理学分级差异显著(P<0.05)。见表4。

2.7卵巢癌患者是否发生化疗耐药多因素分析

以卵巢癌患者是否发生化疗耐药为因变量，以单因素分析差异具有统计学意义的因素为自变量进行多因素Logistic回归分析，结果显示肿瘤最大直径、浸润深度、淋巴结转移、是否复发、Kindlin2阳性表达是患者是否发生化疗耐药的危险因素，病理学分级是保护因素(P<0.05)。见表5。  

表4 Kindlin2蛋白阳性表达与卵巢癌临床病理特征及化疗耐药性单因素分析[n(%)]  

表5卵巢癌患者是否发生化疗耐药多因素分析

2.8 Kindlin2表达与卵巢癌患者术后生存率之间的关系

病例随访回顾性分析发现100例上皮性卵巢癌患者的总术后5年生存率为37%,平均生存时间(30.77±16.95)个月。Kindlin2阴性表达率为37%,Kindlin2阴性表达的卵巢癌患者术后5年存活率(45.9% vs 20.6%)及平均生存时间[(36.25±17.48) vs (21.43±16.72)个月]均明显高于阳性表达者(χ2=7.111、t=9.204,均P<0.01)。见图4。

图4卵巢癌组织中Kindlin2表达与患者 生存率的关系 

3、讨 论

目前，卵巢癌的发生率一直居高不下，而其治疗多采用一种化疗或联合化疗(结合铂类和紫杉烷类治疗)的方式[11],但在长期化疗过程中患者常有肠，膀胱、输尿管和血管受伤的风险，其中许多患者遭受化学疗法引起严重不良反应，此外在临床治疗中化疗耐药频繁发生，最终导致化疗失败，引起患者肿瘤复发或直接死亡[12]。因此，寻找预测卵巢癌发生、化疗耐药、临床预后的生物学标志物，对卵巢癌的诊断及降低化疗耐药发生率和延长患者生存周期具有重要价值。

有报道表明在多种形式的癌症和组织纤维化中有Kindlin2异常表达[13],而且Kindlin2的整联蛋白独立功能在某些疾病方面的发病机制中起着重要作用[14]。有研究发现Kindlin2可促进胰腺癌细胞的增殖和迁移[15],此外也有研究表明Kindlin2通过刺激转化生长因子(TGF)-β诱导的上皮-间质转化激活了癌症相关的成纤维细胞，促进了膀胱癌细胞的侵袭性[16]。Kindlins在各种细胞类型中被检测到，在细胞增殖、迁移、分化和细胞死亡中发挥广泛的生物学功能[17],其机制可能是Kindlin2通过TGF-β、Wnt/β-catenin、Hedgehog、p53等途径参与癌症肿瘤的侵袭-转移级联过程[18]。这些结果提示，卵巢癌中Kindlin2呈高表达，可能参与了卵巢癌的发生和发展，其表达水平可能与组织分化程度和临床分期有关。

卵巢癌患者的治疗选择非常有限，化疗作为一线治疗标准，但患者最终会产生对化疗药物的耐药性[19],因此，寻找使肿瘤对化疗敏感并限制化疗耐药性的方法是延长卵巢癌患者生存期的可行策略。本研究结果预示着Kindlin2的高水平表达可能降低卵巢癌患者对化疗药物的敏感性。也有其他研究表明Kindlin2表达水平决定了转移性前列腺癌细胞对多西紫杉醇诱导的凋亡和细胞死亡的敏感性，Kindlin2的敲除增强了PC3细胞对多西紫杉醇的敏感性，Kindlin2的过度表达增强了这些细胞对多西紫杉醇的抵抗力[20]。而本研究通过细胞实验证实，敲低Kindlin2可有效增强卵巢癌细胞化疗敏感性。这与以上结果具有一致性。Kindlin2表达与不同肿瘤类型的预后有不同的相关性[21],研究表明Kindlin2的表达水平与乳腺癌、膀胱癌等不同癌症的侵袭、淋巴结转移和生存率降低显著相关[22]。也有研究证实，Kindlin2在肺腺癌中的表达水平均显著升高，在肺腺癌中阻断Kindlin2表达可显著降低吡咯啉-5-羧酸还原酶(PYCR)1和脯氨酸水平，减少体内纤维化，从而显著抑制肿瘤生长和降低死亡率[23,24]。本研究结果提示，Kindlin2可能促进了卵巢癌的形成。另外本研究随访结果表明，Kindlin2表达的增强可能是上皮性卵巢癌患者预后不良的指标之一。

综上，Kindlin2在上皮性卵巢癌患者中呈现高表达状态，其高表达降低了患者对化疗药物的敏感性并引起化疗耐药，此外Kindlin2的高表达可能预示着卵巢癌患者的不良预后，其可能成为实体瘤的一个有希望的治疗靶点。但本研究也有一定不足，病例数较少，另外本研究生存率高，可能和患者优质护理方案有关，本研究将在后期扩大样本量，结合基础研究探究其具体机制，来验证实验结果。

参考文献:

[7]薛小伟,李俊来,万文博,等.剪切波弹性成像与Kindlin-2对乳腺结节纤维化程度的评估作用[J].中华医学超声杂志(电子版),2020;17(11):1125-30.

[10]褚超男,黄琪.阿帕替尼治疗复发性卵巢癌的疗效及安全性评价[J].中国新药杂志,2020;29(3):299-302.

基金资助:河北省省级科技计划项目(52777149);

文章来源:赵瑞丽,班春妹,赵玲等.Kindlin2在卵巢癌中表达及其对化疗耐药､临床预后的影响[J].中国老年学杂志,2024,44(03):524-529.