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基于TCGA数据库探究肾透明细胞癌中关键基因的表达及预后作用

2020-09-05 741 上传者：管理员

摘要：目的:探究肾透明细胞癌中关键基因的表达及预后作用,寻找潜在治疗靶点。方法:从TCGA数据库下载肾透明细胞癌mRNA的表达数据,通过Rstudio软件分析肿瘤与正常组织间差异表达基因,对差异表达基因进行富集分析、蛋白-蛋白相互作用网络构建,并分析出关键基因,最后对关键基因进行预后分析。结果:得到1855个差异表达基因,其中有1207个是上调的,648个是下调的,富集分析发现差异基因主要与信号转导、物质代谢、免疫反应等信号通路相关。筛选出10个关键基因中有6个存在预后价值。结论:筛选出的差异基因及信号通路可以帮助我们探索肾透明细胞癌发病的分子机制,同时为靶向治疗的研究提供潜在的理论依据。

关键词：
TCGA
关键基因
肾透明细胞癌
预后价值
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肾癌是常见的泌尿系统肿瘤,近年来其发病人数明显增加,而肾透明细胞癌是其最常见的病理类型,约占肾癌的70%～80%[1]。初诊就已经发生远处转移的患者约占总数的30%[1,2],现阶段手术仍是治疗肾透明细胞癌的主要手段[3],对于手术无法切除晚期肾癌,分子靶向治疗在一定程度上延长了晚期肾癌患者的寿命,但靶向药物仅对20%～40%患者有效[4],所以急需探究肾透明细胞癌发生发展的关键基因,寻找更有效的靶向治疗方法。本研究应用生物信息学方法,从TCGA数据库中下载肾透明细胞癌mRNA表达数据,筛选出差异表达的基因,对差异基因进行系统性分析,进而探究肾透明细胞癌的发生机理,为寻找更有效的分子治疗方法提供一定的理论依据。

1、资料与方法

1.1数据资料

从TCGA数据库下载ccRCC的临床资料及mRNA的表达数据,截至时间为2018年11月5日,该数据集mRNA的表达数据来源于541个ccRCC样本和70个相应的癌旁组织样本。本研究严格遵守TCGA发布的发表指导规范。

1.2分析软件及在线数据库

Rstudio_v1.2.1335(https://www.rstudio.com/products/rstudio/download/)及其附带的“edgeR”包、“pheatmap”包;Cytoscape_v3.7.0软件。

1.3方法

利用Rstudio软件的“edgeR”包筛选出癌与正常组织间差异表达的mRNA,将筛选标准设为|LogFC|≥2,FDR≤0.05。通过在线数据库DAVID6.8对差异表达的基因进行GO和KEGG富集分析;利用在线数据库STRING11.0对差异表达基因进行编码蛋白相互作用网络构建;利用Cytoscape_v3.7.0软件对PPI网络进行上下调基因的标注,同时利用其插件Cytohubba分析PPI网络中的关键基因,应用在线工具KaplanMeierPlotter对关键基因进行预后价值分析。

2、结果

2.1差异表达的mRNA的筛选结果

通过对TCGA数据库中541个ccRCC样本和70个对应的癌旁组织样本处理分析,得到1855个差异表达基因,其中有1207个是上调的,648个是下调的,进一步利用Rstudio软件绘制了差异基因的火山图(图1)。

2.2差异基因的GO富集分析及KEGG富集分析结果

2.2.1GO富集分析

应用数据库DAVID进行富集分析发现,差异基因在分子功能(molecularfunction,MF)方面主要富集在:丝氨酸型肽链内切酶活性、半胱氨酸型内肽酶抑制剂的活性、钙离子结合、激素活性等;在细胞组分(cellularcomponent,CC)方面主要富集在质膜的组成成分、质膜、细胞外基质、胞外区等;在生物过程(biologicalprocess,BP)方面主要富集在G蛋白偶联受体介导的信号通路、蛋白质水解作用、细胞间信号传导、免疫反应等(图2)。

2.2.2KEGG富集分析

应用数据库DAVID进行富集分析发现差异基因主要涉及花生四烯酸代谢、细胞色素P450代谢通路、补体途径、PPAR信号通路、甾类激素合成代谢以及其他营养物质代谢等(图3)。

图1差异表达基因的火山图

图2差异表达基因的GO富集分析结果

图3差异表达基因的KEGG富集分析结果

2.3编码蛋白相互作用网络构建与分析

为分析差异表达基因之间相互作用关系,利用在线数据库STRING11.0对1855个差异表达基因进行蛋白-蛋白相互作用网络(PPI)构建,将相互作用分数设置为0.9,得到了相互作用网络图。并利用Cytoscape_v3.7.0软件将高表达基因标记为红色,将低表达基因标记为蓝色(图4)。

2.4关键基因的筛选

利用Cytoscape_v3.7.0软件插件Cytohubba,采用MCC算法得出CCL5、CCL4、CXCR3、GNG4、GNB3、CCR5、CXCL10、INSL5、TAS2R13、RLN3这10个PPI网络中的关键节点基因(图5),且这10个关键基因中前9位均是上调的,只有RLN3是下调的。

2.5利用KaplanMeierPlotter(http://kmplot.com/analysis/)对10个关键基因进行预后价值分析

发现CCL5、CCL4、CXCR3、GNG4、GNB3、RLN3等基因的表达情况与肾透明细胞癌预后显著相关,CCL5、CCL4、CXCR3、GNG4、GNB3等基因表达越高预后越差(P<0.05),RLN3表达越高预后越好(P<0.05)(图6);而CCR5、CXCL10、INSL5、TAS2R13等基因的表达情况与肾透明细胞癌预后无相关性(P>0.05)。

图4蛋白相互作用网络

图5前10位关键节点基因

3、讨论

肾癌是较常见的泌尿系统肿瘤,早期肾癌的症状不明显,很多患者到病程晚期或者发生远处转移时才确诊[5]。晚期肾癌和转移性肾癌患者的放化疗治疗效果较差,传统的细胞因子治疗效果亦不明显,近年来晚期肾癌基因靶向治疗发展迅速,晚期肾癌的预后获得了极大改善,相较于传统的细胞因子治疗,靶向治疗的患者生存期明显延长[6,7,8]。本研究利用生物信息学分析方法筛选出关键基因,从而为新靶向药物研发提供了潜在靶点。

对本研究筛选出的1855个差异表达基因进行富集分析,发现多条富集通路与肿瘤的发生发展相关。GO分析结果表明这些差异基因主要参与G蛋白偶联受体介导的信号通路、蛋白质的水解作用、免疫反应等生物过程。G蛋白偶联受体(GPCR)调节一系列基本生物过程,例如生长、代谢和体内平衡。GPCR在肿瘤发生发展的多个过程中发挥重要作用,并且被认为是针对多种实体肿瘤的最有用的药物靶标之一[9]。G蛋白偶联受体不仅可以通过MAPKs信号通路来影响异常细胞的生长和存活,还可以通过激活RhoGTP酶和细胞骨架变化以及血管生成促进肿瘤的进展,为肿瘤提供营养并为转移提供途径[10]。研究表明蛋白质水解作用参与肿瘤转移和侵袭进程,在肿瘤进展过程中发挥重要作用[11,12]。KEGG分析结果表明这些差异基因主要与细胞色素P450代谢通路、花生四烯酸代谢、补体途径等代谢通路相关。细胞色素P450介导花生四烯酸环氧化物的生物合成,进而通过驱动血管生成来促进肿瘤生长[13]。国内有研究提出补体活化也有促进肿瘤的作用[14]。

本研究通过在线工具对10个关键基因进行预后分析,发现CCL5、CCL4、CXCR3、GNG4、GNB3、RLN3等基因的表达情况与肾透明细胞癌预后显著相关,CCL5、CCL4、CXCR3、GNG4、GNB3等基因表达越高预后越差(P<0.05),RLN3表达越高预后越好(P<0.05)。其中CCL5及CCL4均为趋化因子,而CXCR3是趋化因子受体家族中的一种。趋化因子(chemokines)是一种细胞因子,参与机体的多种代谢途径和病理、生理过程。趋化因子可通过与相应受体结合,激发一系列下游信号转导反应,最终参与促进肿瘤细胞的侵袭和迁移过程[15,16]。已有多项研究证明趋化因子CCL5与肿瘤的发生发展密切相关。梁亮等[17]研究发现CCL5在ccRCC中的表达强度与恶性程度呈正相关性,进一步随访发现趋化因子CCL5表达程度越高预后越差(P<0.001)。YehCR等[18]研究发现浸润T细胞可通过增加RCC细胞ERβ表达来抑制肿瘤抑制因子DAB2IP信号,从而促进RCC细胞侵袭作用,而CCL5可以促进浸润T细胞向肿瘤细胞的移动,进而加强这一作用。SongE等[19]利用GEO数据库,采用生物信息学分析发现CCL5是肾透明细胞癌的潜在关键基因。研究发现CCL5还参与膀胱癌、前列腺癌、乳腺癌、胃癌、卵巢癌等多种肿瘤的发生发展过程[20,21,22,23,24]。趋化因子受体3(CXCR3)具有多个剪接变体,其中CXCR3-A对细胞增殖起促进作用,而CXCR3-B作用刚好相反。DattaDipak等[25]研究发现CXCR3-A在肾癌细胞中的表达水平明显增高,而CXCR3-B的表达明显降低,进一步研究表明钙调神经磷酸酶抑制剂可以通过下调CXCR3-B和促进增殖信号来介导肾癌的进展[26]。另外,直肠癌细胞可能通过CXCL4/CXCR3轴逃避宿主免疫系统,从而促进了直肠癌的进展[27]。

图6关键基因的预后分析

目前尚未有CCL4、GNG4、RLN3、GNB3等基因与肾透明细胞癌相关研究的报道,其在肾透明细胞癌发生及进展中的作用与机制有待进一步研究,但在其他肿瘤中的作用多有报道。趋化因子CCL4是趋化因子家族的成员,其在口腔鳞状细胞癌中通过驱动血管和淋巴管的生成,从而参与肿瘤的进展[28]。CCL4-CCR5轴可通过介导骨腔中癌细胞与成纤维细胞之间的相互作用,促进乳腺癌向骨转移[29]。基因编码G蛋白γ4亚单位(Gproteinsubunitgamma4,GNG4),是G蛋白中γ亚单位的一种。YangWanli等[30]通过生物信息学的方法发现GNG4可能是结肠癌进展的驱动基因。Palma等[31]通过基因芯片分析发现GNG4在直肠癌中显著上调表达,而Pal等[32]发现GNG4在间充质胶质母细胞瘤中下调表达。G蛋白β3亚单位基因(GNB3)多态性参与人类多项疾病的发生发展[33]。WangYong等[34]通过荟萃分析发现GNB3C825T基因多态性可能会增加患癌风险,尤其是甲状腺癌的风险。也有研究表明GNB3825C>T多态性似乎与乳腺癌风险无关,但可能会影响低度肿瘤转移的发展[35]。松弛素3(RLN3)目前尚未有与肿瘤相关的报道,其在肿瘤中的作用有待进一步探究。

综上所述,本研究利用生物信息学分析方法筛选出CCL5、CCL4、CXCR3、GNG4、GNB3、RLN3等6个存在预后价值的关键基因,可以帮助我们进一步探究肾透明细胞癌潜在的分子发生发展机制,其靶向治疗价值和意义有待后续研究证实。

参考文献：

[5]刘长姣,李明春.肾癌靶向治疗及联合用药的研究进展[J].中国医院药学杂志,2017,37(07):666-669.

[14]宁昌,陈文伟,黎燕,等.补体系统与肿瘤的关系研究进展[J].国际药学研究杂志,2014,41(5):516-521.

[16]刘刚,邵志敏.趋化因子与肿瘤免疫[J].肿瘤,2003,23(5):441-443.

[17]梁亮,邓骞,聂治军,等.趋化因子CCL5表达与肾透明细胞癌病理特征及预后的相关性研究[J].现代肿瘤医学,2018,26(03):405-408.

[33]胡健,李晓辉,胡友梅.G蛋白β_3基因多态性与人类疾病[J].国外医学(生理､病理科学与临床分册),2002,22(3):212-214.

张冲,汤玉锐,关翰,汪亚辉,韩兵,姚越,熊言骏,汪盛.基于TCGA数据库探究肾透明细胞癌关键基因的表达及预后作用[J].现代肿瘤医学,2020,28(19):3294-3298.