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针刺与康复联合疗法调节缺血性脑卒中大鼠神经功能机制研究

2025-01-02 73 上传者：管理员

摘要：目的探究针刺与康复联合疗法调节缺血性脑卒中大鼠神经功能缺损以及炎症反应的相关机制。方法将大鼠分为空白组、假手术组、模型组、针刺组和针刺+康复组，针刺组采取针刺治疗，针刺+康复组采取针刺与康复训练同步进行治疗，共2周。比较各组大鼠神经功能缺损评分，血清中白细胞介素(IL)-17、IL-23含量，脑组织肿瘤坏死因子(TNF-α)、IL-1β及磷酸化核因子(p-NFκB) P65蛋白表达。结果术后14 d针刺+康复组与模型组比较，神经功能改善明显(P<0.05);血清IL-17、IL-23含量差异显著(P<0.01);TNF-α、IL-1β及p-NFκB P65蛋白表达均明显降低(P<0.01)。结论针刺联合康复训练可调节缺血性脑卒中炎性因子以及病变脑组织mRNA的表达。

关键词：
康复疗法
炎症反应
神经功能缺损
缺血性脑卒中
针刺疗法
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缺血性脑卒中是一种严重威胁身体健康的慢性疾病，其发病率及复发率高，已经成为成年人致死、致残的首要危险因素。近年来，由于中国人口老龄化进程加快，风险因子增多，中风的发病率呈现明显年轻化趋势[1]。此病是一种由脑血管供血障碍，引起局部脑组织坏死，从而引起一系列神经功能缺损症状的疾病。此病严重影响人们的生活质量，也给社会、家庭和个人造成了巨大的压力与疾病负担[2,3]。

因此本研究通过观察针刺与康复联合疗法对缺血性脑卒中大鼠神经功能缺损的修复作用，对血清白细胞介素(IL)-17、IL-23表达以及大鼠缺血半暗带肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、IL-1β mRNA表达的影响，从而为缺血性脑卒中患者寻求安全有效的干预措施，以达到缩短病程、提高生活质量、减轻疾病负担的目的。

1、材料与方法

1.1 动物及分组

清洁级健康雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠，鼠龄8～10周，初始体质量为(240±10)g(辽宁长生生物)。在实验开始之前所有大鼠均适应性喂养7 d, 同时跑台训练3 d(速度15 m/min, 时间30 min/d),淘汰掉不自愿参加训练和运动能力达不到训练水平的大鼠，然后用1～60将筛选出的60只SD大鼠进行编号。采用随机数字表法，将上述实验大鼠平均分为5组，分别为：空白组、假手术组、模型组、针刺组和针刺+康复训练组，每组12只，再将各组大鼠进行称重记录和组内随机编号。本实验设计每组样本数为12只，在术后1 d对病变脑组织进行染色，故每组选取2只进行取材处理；并于术后3 d、5 d进行过程观察，每次每组均损耗2只，故于14 d实验结束后每组样本数为6只。本研究已通过辽宁中医药大学实验动物伦理委员会审查[批准号：2013CS(DW)-008-01]。

1.2 主要试剂及仪器

1.2.1 试剂

大鼠IL-17 ELISA试剂盒(上海江莱生物，货号：JL20879);大鼠IL-23 ELISA试剂盒(联科，货号：EK317/3);苏木精(Aladdin, 货号：H104304);曙红Y,醇溶(Aladdin, 货号E118018);IL-1β antibody(美国Abcam, 货号ab283818);TNF-α antibody(美国Abcam, 货号ab307164);羊抗兔IgG-HRP(美国Thermo, 货号31460)。

1.2.2 主要仪器

超速冷冻离心机(H-2050R,湖南湘仪);酶标仪(ELX-800,美国BIOTEK);双垂直蛋白电泳仪(DYCZ-24DN,北京六一);显微镜(BX46,日本Olympus);显微镜拍照系统(SC180,日本Olympus)。

1.3 缺血性脑卒中大鼠模型制备与评价

模型制备前严格控制SD大鼠体质量在(265±15)g, 术前12 h禁食不禁水。制备模型过程中所涉及的术具均进行高压灭菌处理或75%乙醇溶液浸泡。参照Longa[4]法并结合既往研究经验，制备永久性大脑中动脉梗塞大鼠模型(permanent middle cerebral artery occlusion, pMCAO),通过腹腔注射10%的水合氯醛(300 mg/kg)麻醉大鼠。将SD大鼠以仰卧体位固定于操作台，颈部备皮，碘伏消毒后，行颈正中切口，游离颈部术野筋膜及筋膜下肌肉组织，将右侧颈总动脉、右侧颈内动脉及右侧颈外动脉完全显露于视野，再将右侧颈总动脉和右侧颈外动脉进行结扎。使用微动脉夹阻断颈内、颈外血管交汇处血流，并在距离交汇处3～5 mm的右侧颈总动脉适当位置用2 ml注射器针头斜刺一个“V”字形口，将实验前备好的渔线线栓(Φ0.26 mm、长30 mm、过蜡2 mm)从切口处送入血管，轻系活结固定线栓；去除动脉夹，从交汇处起计算插入18～22 mm, 线栓到达大脑中动脉分支起始处，使用Doppler超声监测血流阻闭情况。将固定线栓活结系成死结，全面消毒，逐层缝合。假手术组SD大鼠操作基本同上，但不插入线栓。术后pMCAO大鼠需单笼饲养，并给予相对松软鼠粮。

术后第1天，采用Longa[4]5级4分制标准进行模型筛选，将1～3分的pMCAO大鼠纳入实验。0分、4分或术中死亡的大鼠予以剔除，从备用组中随机补充。见表1。

表1 Longa 5分制神经功能缺损评分

1.4 干预方法

空白组：正常SD大鼠，不进行任何处理。假手术组、模型组：术后置于笼中饲养，不进行任何治疗干预。针刺组：术后1 d, 采取针刺治疗。参照《实验针灸学》[5]定位大鼠针灸穴位。选取百会、大椎、风府、人中，用规格为0.25 mm×25 mm毫针进行针刺，快速行针1 min, 留针1 h, 每日1次，连续治疗14 d。取穴：百会位于顶骨正中；大椎位于第七颈椎与第一胸椎间，背部正中；风府位于枕骨顶嵴后枕寰关节背凹陷处；人中位于唇裂鼻尖下1 mm正中处。针刺+康复训练组：术后1 d, 采取针刺与康复训练同步进行治疗。即在针刺治疗后进行跑台训练(速度15 m/min, 时间30 min/d),每日1次，连续治疗14 d。针刺治疗方案与针刺组一致。

1.5 指标检测及方法

1.5.1 神经功能缺损评估

在术后第7天及第14天分别对每组大鼠采用改良神经功能缺损评分(modified neurological severity score, mNSS)[6]进行评估。评价的主要内容有运动测试、感觉测试、平衡测试及反射消失和不正常运动4个方面，评分范围为0～18分，13～18分为重度神经功能损伤，7～12分为中度神经功能损伤，1～6分为轻度神经功能损伤。

1.5.2 酶联免疫吸附法检测各组大鼠血清中IL-17 IL-23含量

取大鼠血清样本，按照大鼠IL-17、IL-23 ELISA试剂盒说明书中标明的操作步骤进行操作。检测出各组大鼠血清中IL-17、IL-23含量，并计算样本最终浓度。

1.5.3 HE染色法对大鼠病变脑组织形态学进行观察

切除大鼠缺血处的中心坏死区及部分额叶、枕叶、颞叶及小脑，留取缺血坏死区周围的半暗带组织。将留取的各组脑组织修块、编号标记，按照常规流程进行脱水透明，石蜡包埋，设置切片厚度为5 μm行连续切片，并将切片脱蜡至水，依次进行苏木素染色、分化、反蓝、伊红染色，将晾干后的切片置于无水乙醇Ⅰ、无水乙醇Ⅱ中脱水，浸入二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ级中透明，滴加中性树胶，盖上玻片封片后，置于室温使其晾干。并在显微镜下观察脑组织切片染色效果并全片扫描。

1.5.4 Western blot检测各组大鼠缺血半暗带TNF-α IL-1β及磷酸化NF-κB P65的表达

根据各组脑组织样本的质量及体积加入相应体积裂解样本，冰上静置5 min, 低温冷冻离心机，离心力100 05g,4 ℃,离心 10 min, 分离上清液。使用聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白，每孔加20 μl电泳上样液，最后加入5 μl蛋白Marker, 80 V电压恒压电泳2.5 h。电泳结束后将制备的“三明治”插入转印槽内，使用80 V电压转印1.5 h。转印结束后，将PVDF膜浸入5%(M/V)脱脂奶粉溶液中，缓慢摇动1 h。将5%(M/V)脱脂奶粉稀释抗体倒入杂交袋中，放入封闭好的PVDF膜，压膜机封口，加入IL-1β一抗(1∶1000)、TNF-α一抗(1∶1000)进行抗体孵育。将孵育一抗并漂洗好的PVDF膜用压膜机封口，进行羊抗兔IgG-HRP二抗(1∶1000)37 ℃孵育 60 min。将孵育二抗后的PVDF膜均匀洒上ECL发光液，静置反应5 min, 暗室曝光并扫描胶片，用Gel-Pro-Analyzer Software分析目标条带的光密度值。

1.6 统计学方法

采用SPSS 20.0统计软件进行数据分析，所有数据均以均数±标准差

表示，行t检验。P<0.05为差异具有统计学意义。

2、结果

2.1 各组大鼠神经功能缺损评分

不同时间点空白组、假手术组实验大鼠神经功能缺损评分无变化。针刺组和针刺+康复组与模型组比较，术后7 d实验大鼠神经功能缺损评分差异无统计学意义(P>0.05),术后14 d评分均有下降，针刺+康复组评分显著下降(P<0.05);模型组、针刺组和针刺+康复组各组组内术后14 d与7 d神经功能缺损评分比较，均有下降(P<0.05)。见表2。

2.2 酶联免疫吸附法检测各组大鼠血清中IL-17 IL-23含量

针刺组和针刺+康复组大鼠血清IL-17、IL-23含量与空白组、假手术组、模型组比较，差异有统计学意义(P<0.01);针刺+康复组大鼠血清IL-17、IL-23含量与针刺组比较有明显减少(P<0.05)。见表3。

表2 不同时间点各组实验大鼠神经功能缺损评分(只，

表3 各组大鼠血清IL-17 IL-23含量(pg/ml,

2.3 HE染色法对大鼠病变脑组织形态学进行观察

空白组和假手术组大鼠脑组织神经细胞形态、结构正常，无炎性细胞损伤现象。细胞密度大，胞核呈类圆形，细胞核膜清晰，核仁明显。模型组大鼠脑组织缺血区细胞结构疏松，呈现出区域性溶解、肿胀等坏死特征，空泡样改变明显，视野内可以见到部分凋亡小体。针刺组与针刺+康复组缺血半暗带区域病理改变相对较轻，炎性细胞损伤现象较前有所缓解，但针刺+康复组与针刺组相比较而言，细胞排列更为整齐，间质水肿程度轻，细胞皱缩畸形、胞核固缩深染等表现相对较轻。见图1,图2。

图1 各组大鼠病变脑组织染色(术后1 d)

图2 各组大鼠病变脑组织染色(术后14 d)

2.4 缺血半暗带TNF-α IL-1β及磷酸化NF-κB P65的表达

Western blot显示，术后14 d, 模型组TNF-α、IL-1β及磷酸化NF-κB P65的蛋白表达较空白组、假手术组增加，差异有统计学意义(P<0.01);针刺组、针刺+康复组TNF-α、IL-1β及磷酸化NF-κB P65蛋白表达较模型组均明显降低(P<0.01);与针刺组比较，针刺+康复组TNF-α、IL-1β及磷酸化NF-κB P65蛋白表达明显降低(P<0.05)。见表4～表6,图3。

表4 各组大鼠缺血半暗带TNF-α的表达(只，

表5 各组大鼠缺血半暗带IL-1β的表达(只，

表6 各组大鼠缺血半暗带磷酸化NF-κB P65的表达(只，

图3 各组大鼠缺血半暗带TNF-α IL-1β磷酸化NF-κB P65蛋白表达(术后14 d)

3、讨论

脑卒中是典型的脑血管疾病，属于中医学“中风”范畴，其中以缺血性脑卒中较为常见。近年来，西医对缺血性脑卒中治疗时多采用溶栓治疗及血管介入治疗等手段，以达到改善脑组织血液供应、神经功能的目的。但由于存在治疗时间窗口短和可能出现缺血再灌注损伤等潜在不良因素，使上述治疗手段在临床中使用受到很大限制，致残、致死率高，对患者的身体健康造成了极大的危害[6-8]。鉴于此现状，缺血性脑卒中患者迫切需要寻求安全有效的干预措施。

有研究表明，在缺血性脑卒中发生发展的过程中，存在小胶质细胞、免疫细胞、炎性因子(如趋化因子和细胞因子等)影响着缺血性损伤的修复过程[9-13]。炎症反应是病程中的关键环节。发生缺血性脑损伤时，机体炎性因子表达上调，抑制炎症反应可以降低脑损伤并且减轻神经功能损伤。缺血性脑卒中的严重程度与预后情况可以根据炎性因子的变化来判断[14]。

本研究构建了永久性大脑中动脉梗塞大鼠模型，通过观察针刺与康复联合疗法对缺血性脑卒中大鼠神经功能缺损的修复作用，对血清IL-17、IL-23表达以及对大鼠缺血半暗带TNF-α、IL-1β mRNA表达的影响，探究针刺与康复联合疗法调节缺血性脑卒中大鼠神经功能缺损以及炎症反应的相关机制。结果显示，pMCAO大鼠经针刺合并康复训练干预治疗14 d, 神经功能缺损评分明显改善；通过HE染色法对大鼠病变脑组织形态学进行观察，可见针刺合并康复训练有效降低中风后病变脑组织的病理损伤及中风后神经细胞炎性损伤；针刺联合康复训练干预后，检测大鼠血清IL-17、IL-23含量显著降低，TNF-α、IL-1β及磷酸化NF-κB P65的蛋白表达减少，提示有效改善神经功能损伤，证实了针刺合并康复训练能够启动内源性保护机制，抑制炎性反应，并且优于单纯针刺治疗，具有更高的疗效。

由此可见，针刺联合康复训练可在分子水平调节缺血性脑卒中炎性因子以及病变脑组织mRNA的表达，同时可有效改善缺血性脑卒中的神经损伤行为学表现，为针刺联合康复训练治疗缺血性脑血管病提供实验理论依据，更好地指导临床实践。

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