急性脑梗死(acute cerebral infarction ,ACI)是缺血性脑卒中中最常见的一种类型，当脑梗死发生后会导致缺血部位脑组织坏死，从而产生包括：肢体偏瘫、失语、认知障碍等一系列临床症状，严重者可能出现昏迷、脑疝等严重并发症甚至死亡[1]。目前，静脉溶栓和经导管动脉取栓术是治疗缺血性脑卒中的一线治疗方案[2],同时大量实验证实在一定时间内恢复缺血区灌注，可以使脑梗死面积缩小，并与较好的神经功能预后相关[3]。因此，及时诊断和有效治疗对急性脑梗死患者至关重要。

环状RNA(Circ RNA)作为非编码基因RNA的一种，在最初被发现时，学者们一致认为其是基因表达中的垃圾产物或称之为“拼接噪音”[4]。近年来，越来越多的研究证实了Circ RNA参与了缺血性脑卒中的调控网络，对ACI的发生具有一定的影响[5,6],并且在ACI的诊断以及预后评估中具有潜在的价值[7]。

在本次研究的过程中，通过高通量测序发现了ACI患者外周血中差异性最大的Circ RNA基因为Circ RNA -BBS9(Circ-BBS9),然而在国内外现有研究中，关于ACI相关的Circ RNA并未报道过Circ-BBS9。鉴于此，本研究通过探究Circ-BBS9在急性脑梗死患者外周血中的表达情况，以期为Circ RNA作为ACI疾病预测标志物提供一定的理论依据。

1、对象与方法

1.1 研究对象

选取2021年1月至12月收治的34例急性脑梗死患者作为病例组。纳入标准：符合《中国急性缺血性脑卒中诊治指南2018》[8]关于急性脑梗死的诊断标准，满足中国缺血性卒中亚型—CISS分型中的卒中分类标准，且经头颅CT或MRI检查证实，CISS分型为动脉粥样硬化性脑梗死；发病时间不超过7 d; 初次确诊并且在治疗过程中未再次发生脑梗死。排除标准：具有脑出血病史或者在检查中显示伴有脑出血；患有恶性肿瘤；心、肝、肾功能障碍；存在严重心律失常；因心源性栓塞引起的脑卒中；腔隙性脑梗死。并选取同时期的41例非脑梗死患者作为对照组。所有参与本次试验的患者均已知情并签字。

1.2 收集资料

收集两组患者的资料，包括：①一般资料：性别、年龄、既往疾病史(包括：高脂血症史、高血压病史、糖尿病病史及冠心病史)、吸烟史及饮酒史；②临床检测指标：血压、血糖和血脂(胆固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白胆固醇、高密度脂蛋白胆固醇)。

1.3 筛选Circ RNA

患者办理入院手续后30 min内，采集患者肘静脉血液4 mL,将其置于红色无添加全塑干燥管中，在常温环境中以3 000 r/min离心10 min, 然后吸取上层血清测量生化相关指标；另外采集肘静脉血液4 mL于血常规管中用于检测筛选出的Circ RNA(目的基因)的表达水平。每组随机各选择3例样本做全转录测序，筛选出差异的Circ RNA,通过实时荧光定量PCR方法进行验证该Circ RNA的表达差异。本次研究全转录测序交由上海懿贝瑞生物医药科技有限公司完成。

1.4 主要试剂与仪器

(1)主要试剂：①Trizol(Thermo scientific, 批号：00760321);②预混液形式的RT-qPCR 首选试剂(去基因组)(sangon Biotech, 批号：B532451-0010);③高特异性染料法定量PCR检测试剂(Vazyme, 批号：R10322);④Primer(R&F)(Biosharp, 批号：23107538)。(2)主要仪器：①Nanodrop 分光光度计(Thermo, 型号：2000/2000C);②稳压电泳仪(BIO-RAD,型号：041BR308910);③Real time PCR 仪器(ABI,型号：Ⅶ7)。

1.5 实时荧光定量PCR检测目的基因的表达水平

(1)严格根据sigma 公司的 Trizol 操作说明书进行总 RNA 抽提；(2)将 4× gDNA wiper mix 和1.0 μg total RNA加入至PCR管中，补充RNase-Free H2O至8 μL,混匀后离心，42 ℃温浴 2 min, 加入 5×qPCR supermix 55 ℃ 15 min, 85 ℃ 2 min 程序进行逆转录，将得到的 RT 产物cDNA 置于-80 ℃保存备用。(3)实时荧光定量PCR反应：每管加入5.0 μL PCR检测试剂、0.25 μL 上游引物(10 μmol/L)、0.25 μL下游引物(10 μmol/L)、0.2 μL Dye2、2.0 μL cDNA 、2.3 μL RNase-Free H2O,制定反应液。分别加入到对应PCR管中，短暂离心并确保反应液全部在试管底部。反应仪中放入96孔板，进行如下反应程序：①95 ℃反应15 min起始模板变性→②94 ℃反应20 s变性→③60 ℃反应34 s退火，重复进行②、③步骤42个循环。(4)循环结束后采集荧光数据，目的基因表达相对值的计算采用 2-ΔΔCT法。

1.6 观察指标

对比两组的一般资料及目的基因表达水平，分析急性脑梗死的危险因素，并分析一般资料及目的基因表达水平与急性脑梗死发生的相关性。

1.7 统计学方法

采用SPSS 26.0软件对数据进行统计学分析，所有数据进行正态性检验，符合正态分布计量资料用

表示，组间比较采用成组t检验；计数资料用n(%)表示，采用χ2检验。数据呈正态分布，相关性分析使用Pearson分析，若数据呈非正态分布，相关性分析使用Spearman分析。相关影响因素分析采用二元Logistic回归分析。目的基因表达水平对急性脑梗死的诊断价值分析采用ROC曲线分析。当P<0.05为差异有统计学意义。

2、结果

2.1 Circ RNA的筛选结果及引物合成

经过全转录测序后获得5个差异的Circ RNA,即Circ-GRHPR(chr9:37425919-37426651)、Circ-SRRM2(hsa_circ_0037563)、Circ-IFT80(hsa_circ_0067835)、Circ-STAG1 (hsa_circ_0122080)及Circ-BBS9(hsa_circ_0079812),选择其中差异性最大的基因Circ-BBS9(hsa_circ_0079812)作为目的基因。以GAPDH为内参基因来标准化样品，通过查阅相关的文献资料获得GAPDH与Circ-BBS9的序列等信息，由上海懿贝瑞生物医药科技有限公司合成所需引物。见表1。

表1 Real-time RCR 引物序列

2.2 两组的一般资料与临床检测指标比较

病例组与对照组的高脂血症病史率、糖尿病病史率、空腹血糖、胆固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白胆固醇及高密度脂蛋白胆固醇水平无统计学意义(P>0.05),病例组的男性占比、年龄、高血压病史率、冠心病病史率、吸烟史占比、饮酒史占比、血压水平均高于对照组(P<0.05)。见表2。

2.3 两组的Circ-BBS9表达水平

通过实时荧光定量PCR检测病例组与对照组样本中的Circ-BBS9表达水平。结果表明，病例组的Circ-BBS9表达水平明显低于对照组，具有统计学意义(P<0.05)。见图1。

表2 两组的一般资料与临床检测 指标比较

图1 对照组与病例组的Circ-BBS9表达水平

2.4 一般资料与临床检测指标及Circ-BBS9表达水平的相关性分析

分别对两组的一般资料、临床检测指标及Circ-BBS9表达水平进行相关性分析。结果显示，男性、年龄、高血压患病史、冠心病患病史、吸烟史、饮酒史、血压水平与急性脑梗死的发生呈正相关(P<0.05),Circ-BBS9表达水平与急性脑梗死的发生呈负相关(P<0.05)。见表3。

2.5 急性脑梗死的相关影响因素分析

将急性脑梗死的发生与否作为因变量，将表3中经统计学对比存在显著差异的因素作为自变量纳入多因素分析中。在多因素分析的结果中显示：性别、年龄、高血压患病史、冠心病患病史、吸烟史、饮酒史及血压水平均是急性脑梗死发生的相关影响因素(P<0.05),Circ-BBS9是急性脑梗死发病的保护因素(P<0.05)。见表4。

表3 一般资料与临床检测指标及Circ -BBS9 表达水平的相关性分析

表4 急性脑梗死的相关影响因素分析

2.6 Circ -BBS9诊断急性脑梗死价值的ROC曲线分析

Circ-BBS9诊断急性脑梗死价值的ROC曲线下面积为0.712,最佳截断值为1.46,其灵敏度为0.875,特异度为0.749,约登指数为0.624。见图2。

3、讨论

Circ RNA是一种通过特殊的选择性剪接方式产生的非编码RNA,可通过选择性海绵吸附进行微小RNA(mi RNA)的表达水平或者活性调节[9]。Circ RNA在细胞质中与信使RNA进行mi RNA的竞争，降低mi RNA对其靶基因的抑制作用，促进靶基因的表达[10]。不同Circ RNA还参与了多种疾病的发生，包括糖尿病、心血管系统疾病、神经系统疾病等[11,12],Circ RNA在急性脑梗死发病过程中的异常表达可能参与神经元细胞的自噬、凋亡等病理过程[13,14]。近年来随着Circ RNA在疾病研究中的范围越来越广，缺血性脑卒中领域对Circ RNA的预测价值引起了重视，希望通过研究Circ RNA与这类疾病发生的相关性，为预测该疾病的发生提供更多的思路。

图2 Circ -BBS9诊断急性脑梗死价值的ROC曲线

本研究发现性别、年龄、高血压病史、冠心病病史、吸烟史、饮酒史、血压水平以及高密度脂蛋白胆固醇与ACI发生存在明显关联性，且为独立的影响因素。这与既往的相关研究结果类似[15]。在吴旭龙等的研究中发现了hsa_circRNA_104600表达水平与急性缺血性脑卒中的发生存在密切关系[16]。在另外的研究中还报道了，RNA circ_0003204的表达与动脉粥样硬化病理中内皮细胞异常表型存在密切关联[17]。表明Circ RNA可能参与了急性脑梗死的发病。然而人体内存在着不同的Circ RNA,发现更多不同的与急性脑梗死发病相关的Circ RNA,能够为Circ RNA作为标志物诊断、预测急性脑梗死提供更多的证据。

本次研究共筛选出5个差异性基因，即Circ-GRHPR(chr9:37425919-37426651-)、Circ-SRRM2(hsa_circ_0037563)、Circ-IFT80(hsa_circ_0067835)、circ-STAG1 (hsa_circ_0122080)及Circ-BBS9(hsa_circ_0079812),其中差异性最大的基因为Circ-BBS9(hsa_circ_0079812)。病例组的Circ-BBS9表达水平低于对照组，Circ-BBS9表达水平与急性脑梗死的发生呈负相关，并且在多因素分析中显示其在外周血中的表达水平降低是急性脑梗死发病的危险因素。在一项关于肺部炎症小鼠的研究中显示[18],作为环境污染中重要成分的PM2.5,会通过激活核苷酸结合结构域和富含亮氨酸重复蛋白3(NLRP3)炎症小体而造成肺组织中的白细胞介素(IL)-1β与IL-18的表达升高，加重肺部组织的炎症反应，且研究发现Circ -BBS9参与了该炎症机制的发生。而NLRP3炎症小体与急性脑梗死的发生具有密切关联[19]。相关研究报道，与健康者相比，急性脑梗死患者的NLRP3 mRNA表达水平显著升高[20]。由此推测，Circ-BBS9可能通过影响NLRP3炎症小体的激活而促进了急性脑梗死的发生。在本次研究中显示，病例组患者外周血中的Circ-BBS9相比对照组呈现为更低水平的表达。分析出现该种现象的原因：基于其他相关的Circ RNA研究[21],推测在急性脑梗死发病患者中，由于脑组织中的Circ -BBS9更多地与相关促进发病的mi RNA结合，调节下游靶基因的表达，影响急性脑梗死的发病，进而释放于外周血的游离或外泌体包裹的Circ -BBS9减少，使得外周血中的Circ -BBS9表达水平降低。

本次研究还显示，Circ-BBS9诊断急性脑梗死价值的ROC曲线下面积为0.712,最佳截断值为1.46,其灵敏度为0.875,特意度为0.749,约登指数为0.624,提示Circ -BBS9诊断急性脑梗死价值为中等，结合Circ-BBS9与急性脑梗死的相关性P值为0.015,考虑两者存在较为明显的差异性，而诊断价值中等可能的原因一方面是采集患者入院30分钟内静脉血，未剔除饮食对于实验结果的干扰，但由于本实验的目的是探究Circ-BBS9早期诊断急性脑梗死的可能性，因此该部分误差难以避免；同时急性脑梗死发生后中性粒细胞大量释放，在发病后第一个小时内即可在脑及外周微血管中出现[22],中性粒细胞可以释放诸多炎性因子，因此对于试验结果也存在一定的影响；另一方面，当急性脑梗死发病后，Circ-BBS9在中枢神经系统及外周血中不会立即发生改变，由于每名患者发病时间不同、入院时间不同，因此存在一定的误差，后续可以通过检测每小时外周血中Circ-BBS9的变化，确定其降低峰值及持续时间等重要指标。

综述上述，急性脑梗死患者外周血的Circ -BBS9表达水平明显降低，Circ -BBS9表达水平与急性脑梗死发生呈负相关；Circ -BBS9表达水平是影响急性脑梗死发生的独立因素；外周血检测Circ-BBS9具有预测急性脑梗死发病的潜在价值，但是这一观点还需要通过进一步的Circ -BBS9调控通路研究进行证实。

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基金资助:内蒙古自治区科技计划(2020GG0212);

文章来源:张海燕,袁瑞,周文荟,等.急性脑梗死外周血中Circ-BBS9的表达水平及临床意义[J].包头医学院学报,2024,40(06):43-48.