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外周血环状RNA730对尿源性脓毒症的诊断价值

2020-10-31 207 上传者：管理员

摘要：目的:探索外周循环血环状RNA730(circRNA730)对尿源性脓毒症早期诊断及预后评估的价值。方法:选择2019年1～11月同济大学附属同济医院泌尿外科及外科重症监护病房(SICU)尿源性脓毒症患者40例,取外周循环血并提取血总RNA,收集患者临床资料并随访患者预后。同时选取健康对照人群40例,取其外周血并提取血总RNA,使用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)比较两组人群外周血circRNA730相对表达情况并用ΔΔCT法进行分析。绘制受试者工作曲线(ROC曲线)判断circRNA730对尿源性脓毒症的诊断效能,随访患者28 d,记录患者预后情况,比较生存组与死亡组外周血circRNA730的相对表达情况并分析circRNA730对患者预后判断的意义。结果:尿源性脓毒症组与健康对照组患者外周血circRNA730表达存在明显差异(P<0.001),受试者工作曲线(ROC曲线)提示circRNA730对尿源性脓毒症的诊断有较好的价值,ROC曲线下面积AUC为0.827。死亡组外周血circRNA730相对表达量较生存组较高,但两组circRNA730表达情况无明显差异(P=0.547)。结论:外周血circRNA730可以作为尿源性脓毒症早期诊断的生物标准物。

关键词：
尿毒症
尿源性脓毒症
泌尿系感染
环状RNA730
生物标志物
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脓毒症及脓毒性休克常病情危重,严重威胁患者的生命。泌尿系感染是临床上的常见病与多发病。很多患者因发现不及时或治疗不当而发生尿源性脓毒症。尿源性脓毒症作为脓毒症的常见类型,具有高发病率及高死亡率的特点[1]。因此,早期识别尿源性脓毒症并及时加以治疗对于改善患者预后,降低休克的发生率、提高患者生存率均有重要的意义。脓毒症的产生与全身炎症反应存在紧密联系。而脓毒性休克更是由于严重感染引发全身炎症反应严重失调并最终引发循环乃至多器官功能障碍并出现休克表现的危急状态[2]。现在有许多研究发现circRNA可以导致包括神经系统疾病,内分泌系统疾病及多种肿瘤的发生。另外,现已经有研究表明circRNA可以调节免疫因子[3],因此环状RNA可能与脓毒症的发生存在关系。我们通过分析circRNADc数据库发现了与肿瘤坏死因子(TNF)信号通路相关的环状RNA730(circRNA730)。CircRNA730,又名为circ_0016354,由RCOR3基因剪接而成,具体位置为chr1:211444573-211469095。作为炎症反应调节的重要通路之一,TNF信号通路在脓毒症的发生发展过程中起着重要作用。因此,circRNA730也可能对脓毒症的产生起着重要作用。本研究旨在探索外周血circRNA730对尿源性脓毒症早期诊断及预后判断的意义。

1、资料与方法

1.1临床资料

40例入组患者均为2019年1～11月在同济大学附属同济医院泌尿外科或外科重症监护病房(SICU)住院治疗的尿源性脓毒症患者,诊断按2016年脓毒症及脓毒性休克的第3次国际共识定义(Sepsis-3)[1]。明确诊断后均在24 h内采血。同时根据28 d病死率情况分为生存组(n=37)及死亡组(n=3)。健康对照组人群均来自在同济大学附属同济医院体检者,收集入组者基本信息,同时结合体检结果剔除不符合入组要求者。纳入健康对照组共40例,男20例,女20例,平均年龄(65.48±8.54)岁,平均BMI(24.72±3.40) kg/m2。两组平均年龄(t=1.895,P=0.061)、性别构成(χ2=0.200 8,P=0.654 1)及BMI(t=0.089,P=0.929)均无明显差异,具有可比性。排除标准:①年龄<18岁;②患者存在HIV感染或其他免疫功能受损情况存在;③存在恶性肿瘤或终末期患者;④脓毒症及脓毒性休克不是由泌尿系统感染引发;⑤患者不愿加入本研究或其他因素。患者基本信息见表1。本研究为前瞻性研究,经同济大学附属同济医院伦理委员会审批(伦审-KYSB-2018-142)。患者、家属及健康对照者均充分告知并自愿加入,后签署知情同意书。

1.2血标本准备及实时定量聚合酶链式反应(RT-PCR)

使用抗凝管采集受试者血样5 mL,采血24 h内使用Trizol提取血总RNA并利用cDNA合成试剂盒反转录形成cDNA。使用专门的SYBR Green qPCR Mix进行实时定量聚合酶链式反应(RT-PCR)扩增混合材料进行qPCR扩增。通过circBase数据库我们获得了circRNA730和GADPH的引物序列,见表2。之后我们请上海生工生物工程公司帮我们合成引物。所得到的结果均使用ΔΔCT法进行相对表达量计算。其中ΔCt=Ct(目的circRNA)-Ct(GADPH),ΔΔCt=ΔCt(尿源性脓毒症组)-ΔCt(健康对照组)。ΔCt值越大,circRNA表达水平越低。

表1尿源性脓毒症患者基本资料

表2 circRNA730与GADPH引物序列

1.3临床指标

收集所有入组患者生命体征及临床检查资料,如体温、血压、精神状态及基础疾病,检查指标如血常规、血生化、凝血功能,收集免疫相关指标如TNF-a、IL-1、IL-6、IL-8等。

1.4病情判断

根据Sepsis-3标准,结合收集到的临床资料进行序贯器官衰竭评估(SOFA)评分,同时结合患者既往疾病及最初检查指标评价基础SOFA评分,当SOFA评分较基线上升≥2分即诊断为尿源性脓毒症。收集患者28 d随访资料,评估患者预后情况。

1.5统计学方法

应用SPSS 25.0统计软件对数据进行分析。符合正态分布的计量资料以x¯±s表示,两组间比较采用t检验,多组间比较采用方差分析;偏态分布的计量资料以中位数(四分位数)[M(QL,QU)]表示,组间比较采用Kruskal-Wallis秩和检验。计数资料以例数或百分比表示,组间比较采用卡方检验进行分析。评价指标的诊断价值采用受试者工作曲线(ROC曲线)分析敏感性与特异性。以P<0.05为差异有统计学意义。

2、结果

2.1外周血circRNA730对尿源性脓毒症的诊断价值

尿源性脓毒症组与健康对照组外周血circRNA730相对表达量存在明显差异(P<0.001),见图1。绘制ROC曲线分析circRNA730对尿源性脓毒症的诊断价值,ROC曲线下面积AUC=0.827,95%可信区间(95%CI):0.672～0.982,敏感性为80%,特异性为87%。同时,我们分析了C-反应蛋白(CRP)的诊断价值,其ROC曲线下面积为0.813,95%CI:0.652～0.975,敏感性为76%,特异性为84%(图2)。这表明circRNA730对尿源性脓毒症有较好的诊断价值。

图1尿源性脓毒症组与健康对照组外周血circRNA730相对表达情况

图2 circRNA730和CRP对尿源性脓毒症诊断的ROC曲线

2.2 circRNA730与主要临床指标的关系

我们收集了脓毒症患者的主要临床指标并利用相关性分析分析了circRNA730与其表达的关系,我们发现circRNA730与肌酐(P=0.001 4),乳酸(P<0.001),CRP(P=0.013),TNF-α(P=0.04),IL-6(P=0.003 2),和IL-8(P<0.001)等指标均有明显的相关性,另外其与SOFA评分也存在明显关系(P<0.001),见表3。这些结果表明circRNA730与免疫指标及患者病情严重程度的指标存在明显关联。

2.3 circRNA730对患者预后价值的分析

经过28 d随访,我们发现有3例患者最终治疗无效而死亡,我们分析了死亡患者与生存患者血circRNA730的表达情况发现生存组与死亡组之间circRNA730的相对表达量并无明显差异(P=0.547),见图3。不过我们进一步分析发现3例死亡患者外周血circRNA730的表达相较于脓毒症组均值有明显升高(表4)。这表明circRNA730的表达情况可能与患者预后的好坏存在一定关联,但由于样本量较少,目前的结果需要进一步验证。

表3 circRNA730与主要临床指标的相关性

图3尿源性脓毒症死亡组与生存组外周血circRNA730的相对表达情况

表4死亡患者外周血circRNA730相对表达情况

3、讨论

脓毒症是临床上常见的危重症,是由于人体对感染的反应失调导致全身各个器官功能受损的综合征。美国CDC研究发现,脓毒性休克是重症监护病房(ICU)的首要死亡原因,且在1999～2014年其发病总人数增长了31%[4,5]。在我国,脓毒症的患病情况同样十分严重,2014年协和医院曾对北京地区脓毒症发病情况进行了调查,并估计我国每年约有500万人左右的脓毒症患者而且总死亡率超过30%[6]。相较于传统的脓毒症,尿源性脓毒症有着更高的发病率与死亡率。根据2016年国际脓毒症及脓毒症休克指南的数据,尿源性脓毒症约占脓毒症的20%～30%[1],相比于单纯的脓毒症,尿源性脓毒症更易导致休克的发生并最终导致患者死亡。Levy等[7]在2012年曾对欧洲及美国的所有脓毒症个案进行统计,他们发现有大约有9%～31%的脓毒症是由于泌尿系统感染引起,共有260～980万例,其中死亡人数高达160万。虽然目前我国尚无诊断尿源性脓毒症的流行病学研究,但可以想象,我国的尿源性脓毒症病情同样严重。因此,早期识别尿源性脓毒症并及时加以治疗对于改善患者预后提高患者生存率有着重要意义。

目前,已经有许多生物标志物应用于临床协助诊断脓毒症。其中,比较常见的有CRP、降钙素原(PCT)以及IL-6。但这些指标多少均存在不足。CRP是一种急性期蛋白,其在各种急性炎症,急性损伤乃至脓毒症中都会有明显的升高。CRP通常在感染后4～6 h开始上升,48 h左右到达巅峰[8]。不过,CRP的表达易受到机体免疫状态的影响。当机体发生免疫抑制时,血清中CRP无法升高[9]。另外,还有学者指出CRP在脓毒症的临床诊断中的特异性较低,常难以反映全身感染的严重程度,仅使用血清CRP水平对脓毒症患者分级诊断和感染程度判断并无意义[10]。PCT通常仅由甲状腺滤泡旁细胞分泌,但当患者发生感染时由于细菌的作用,将导致全身各组织均会分泌PCT,从而导致血清中PCT水平急速升高。血清PCT常于感染发生后2～3 h开始上升,在8～24 h后到达巅峰[11]。但许多因素能影响到PCT的表达,当患者存在肾功能不全或既往出现过脓毒症等情况时均会引发PCT的异常过度表达[12]。IL-6是一种促炎反应因子,在健康人群中血清IL-6浓度通常较低,仅为1～5 pg/mL,但机体出现感染后,血清IL-6含量会在较短时间内急剧升高,随着血清IL-6含量升高,B细胞增殖会增快,并促进炎症反应的产生[13]。不过,有学者发现学者通过对重症多发伤、脓毒症及健康体检者进行研究发现在重症多发伤和脓毒症其血清IL-6表达水平相近,明显高于健康体检者[14]。这表明IL-6对脓毒症诊断的特异性不足。

现研究已经证实,过度的免疫反应是导致包括尿源性脓毒症在内所有脓毒症的重要致病原因。炎性因子作为调控炎症免疫反应的重要因素,其与脓毒症的发生有着密切的关联。Hansen等[15]研究证实circRNA可以直接或间接通过调节miRNA从而对炎性因子的表达进行调控。所以,circRNA可能是导致脓毒症发生的重要调节因素。另外,作为一种闭合环状RNA,circRNA没有5’端的帽子结构和3’端多聚腺苷酸化的尾部结构,使其不易被核糖核酸外切酶R(RNase R)降解并能稳定的存在于人体各组织、器官中[16]。因此,circRNA相对于传统的诊断指标可能有着更好的诊断价值。

现在已有动物实验表明circRNA对于脓毒症的发生起着重要的作用。多伦多的一项研究发现编码FOXO蛋白的基因也可编码一种circRNA Foxo3;circRNA Foxo3在感染性休克小鼠的心脏中高表达,其主要作用机制为与位于细胞质中转录因子E2F1以及抗应激蛋白的相互作用,从而使它们丧失了抗应激功能,进而导致细胞凋亡[17]。另一项对于大鼠脓毒性休克模型的研究发现并比较了circRNA在休克模型组和对照组心肌组织中的相对表达情况。他们发现11种表达明显异常的circRNA(其中7种上调,4种下调)并通过生物信息学技术分析了这11种circRNA可能的调节通路[18]。

在本研究中,我们发现外周血circRNA730在尿源性脓毒症的患者中表达与健康对照组存在明显的差异。另外,我们还发现circRNA730比传统的诊断指标如CRP有着更好的诊断价值。结论显示circRNA730对于患者的预后好坏并没有预测价值,但在不同预后的患者中circRNA730的表达确实存在差异;但由于样本量较少,差异无统计学意义,可能需要纳入更多样本进一步验证。

综上所述,circRNA730对尿源性脓毒症的早期诊断有着较好的价值,将来可能作为尿源性脓毒症早期诊断的生物标志物。另外,circRNA730的表达量可能对患者的预后起着一定的提示作用。但仍需要多中心大样本的研究来加以验证。

参考文献：

[2]沈杰,顾燕青,沈俭.CRP在肾绞痛､输尿管结石患者并发严重上尿路感染诊疗中的应用价值[J].临床泌尿外科杂志,2018,33(5):410-412.

[10]王宾,王红.C反应蛋白､降钙素原､中性粒细胞表面CD35和CD64诊断脓毒症的临床价值[J].临床和实验医学杂志,2017,16(8):752-755.

[13]王莹,王晓琴,陈正岗,等.降钙素原､白细胞介素-6及D-二聚体动态检测对儿童脓毒症早期诊断的临床意义[J].中国临床医生杂志,2017,45(11):100-102.

[14]付玉梅,王俊红,张冲,等.急诊重症多发伤患者合并早期脓毒症血清PCT､IL-及CRP水平检测的临床价值分析[J].现代诊断与治疗,2019,30(10):1660-1661.

陈曦,张磊,吴登龙,卞崔冬,姚怿聪,吴刚,周娟.外周血环状RNA730对尿源性脓毒症诊断价值的研究[J].临床泌尿外科杂志,2020,35(11):897-901.

基金:上海市卫健委临床研究专项计划(No:20184Y0263､20184Y0105)