恶性胶质瘤是中枢神经系统中常见的、致命性肿瘤，病人的预后较差，其中胶质母细胞瘤(glioblastomas, GBM)病人的中位生存期仅为16个月[1]。目前，尚无恶性胶质瘤有效的预后或治疗靶点，因此，探索功能性肿瘤相关基因不仅可发现神经胶质瘤进展的新机制，还可识别治疗干预的可能靶点。Krüppel样因子(Krüppel-like factor, KLF)成员包括KLFs1-17,是含锌指结构的转录因子，在细胞的分化和发育调节及恶性肿瘤的生物学发展过程中起着至关重要的作用[2]。研究表明，KLF转录因子在不同的细胞背景下充当癌基因和/或肿瘤抑制因子[3]。研究发现，KLF9可调节孕酮反应启动子的反式激活，并在多种癌组织中异常表达，表明KLF9上调可能与癌症发展有关[4-5]。因此，更好地理解KLF9在胶质瘤进展中的表达模式和生物学作用可能为寻找治疗干预的新靶点提供线索。KLF9可通过结合基因启动子区富含GC的DNA序列来调节致癌或肿瘤抑制基因，从而在肿瘤发生中发挥重要作用[6]。线粒体是代谢稳态的基础[7]。线粒体功能由各种线粒体生物发生基因调节，这些基因控制线粒体DNA(mitochondrial DNA,mtDNA)的复制和线粒体编码蛋白的转录，mtDNA拷贝数的改变可影响氧化磷酸化和能量代谢，导致GBM中的线粒体功能障碍，并且高mtDNA与GBM的不良预后和治疗抵抗相关[7-8]。研究发现，KLF9可通过驱动mtDNA拷贝数上调减轻布比卡因神经毒性[9]。因此，本研究探讨KLF9水平及mtDNA拷贝数与恶性胶质瘤的潜在联系。

1、资料与方法

1.1研究对象

选取2020年6月—2022年12月本院神经外科收治的GBM病人28例作为研究对象，其中，男15例，女13例，年龄15～64(50.14±13.08)岁。所有病人均为首次诊断，即术前无化疗或放疗治疗史。留取脑胶质瘤标本，所有标本均经病理证实，并保存于-80℃,根据世界卫生组织(WHO)神经系统肿瘤分类标准(2016年修订版)[10],本研究28例标本均为高度胶质瘤(Ⅲ级或Ⅳ级)。另选择同期因脑外伤而行颅骨减压术病人10例作为对照组，并留取其非癌脑组织。本研究经医院医学伦理委员会批准(伦理编号：2019-12),所有受试者均签署知情同意书。

1.2免疫组化SP法检测非癌脑组织和脑胶质瘤组织中KLF9蛋白水平

石蜡包埋的组织切片在60℃的烘箱中烘烤15min,用3%的过氧化氢封闭内源过氧化物酶10min。磷酸缓冲盐溶液(PBS)冲洗后，将切片浸入pH=6.0的柠檬酸缓冲液中，接受微波抗原热修复10min,然后在室温下冷却。为了避免非特异性染色，用正常山羊血清处理切片，然后在4℃下用抗KLF9抗体(1∶100稀释，美国Abcam公司)孵育过夜。PBS洗涤载玻片3次，每次3min;施加第二抗体并在室温下孵育1h。再用PBS洗涤3次，每次3min,加入DAB显色剂并孵育5～10min,在显微镜下控制显色时间，并用蒸馏水冲洗终止反应。在苏木精重新染色并用蒸馏水充分冲洗后，使用1%乙醇-盐酸进行区分，随后用蒸馏水再次彻底冲洗。常规脱水、二甲苯处理、中性树脂固定后，在显微镜下观察细胞染色。

两名有经验的病理学家独立评估阳性肿瘤细胞的百分比及其染色强度。KLF9蛋白的表达被定义为细胞质中的棕黄色染色。在显微镜下(×400)随机选择5个视野，并计算免疫反应得分。KLF9染色强度分数分配如下：阴性(0分)、弱(1分)、中等(2分)和强(3分)。阳性肿瘤细胞百分比的分数确定如下：0%～25%计1分、26%～50%计2分、51%～75%计3分和76%～100%计4分。每个切片的免疫反应得分为染色强度得分和肿瘤细胞百分比得分的乘积。

1.3生物信息学分析

采用在线数据库基因表达谱交互式分析平台(GEPIA,http: //gepia.cancer-pku.cn/index.html)分析KLF9在胶质瘤组织和正常组织中的表达。采用GSE16011数据集进行基因表达、相关性和生存分析。

1.4蛋白免疫印迹法

使用放射免疫沉淀检测缓冲液(上海Beyotime公司)提取总细胞蛋白样品，并用Bradford蛋白质测定试剂盒(上海Beyotime公司)测量蛋白浓度。蛋白样品通过12%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离，然后转移到硝酸纤维素膜上(美国Pall公司)。用5%脱脂乳封闭膜，然后用特异性针对前序列转位酶23(Tim23,1∶1 000,美国Proteintech公司)、KLF9(1∶1 000,美国Abcam公司)、线粒体外膜20易位酶(Tom20,1∶1 000,美国CST公司)、细胞色素C氧化酶Ⅳ亚型(COXⅣ,1∶1 000,美国Proteintech公司)或抗内参甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)抗体(1∶1 000,美国Proteintech公司)在室温下反应1h,并用Tris-HCl缓冲盐溶液(TBST)洗涤4次，每次15min。通过Tanon高信号增强化学发光法(ECL)蛋白质印迹基质(中国Tanon公司)在iBrightcl750成像系统(美国Invitrogen公司)显现蛋白条带。

1.5实时荧光定量聚合酶链式反应(RT-PCR)检测KLF9 mRNA的表达

采用TRIzol溶液分离100mg冷冻样品的总RNA,然后合成cDNA。以cDNA为模板进行聚合酶链式反应(PCR)。PCR反应条件为，95℃预变性5min;95℃30s,56℃30s,72℃30s,共30个循环；随后在72℃延伸5min。琼脂糖凝胶电泳后，PCR产物通过ChemiDoc XRS+凝胶成像系统成像，并通过Image LabTM5.2.1软件分析。通过目标条带和内部参考条带之间的累积光密度的比率来确定KLF9mRNA的表达。RT-PCR引物由上海生工生物技术有限公司合成。目的基因KLF9正向引物为5′-ATATCCTCTTGACAATTGCT-3′,反向引物为5′-GAATGATCCACATGTCTCG-3′,预期条带为320bp。GAPDH正向引物为5′-TGGGACGACATGGAGAAAA-3′,反向引物为5′-CAGGAAGGAAGGCTGGAAG-3′,其扩增片段长度为567bp。

1.6细胞培养

人星形胶质细胞(HA)、人神经胶质瘤细胞系(LN229、U87)、GBM病人来源的细胞系N33购自美国典型培养物保藏中心(ATCC)。HA在星形胶质细胞培养基(美国Gibco公司)中培养。LN229、U87在含10%胎牛血清和1%青霉素-链霉素的DMEM培养基(美国Gibco公司)中培养。N33在含有10%FBS和1%青霉素-链霉素的DMEM/F12(美国Gibco公司)中培养。所有细胞都在37℃和5%CO2下培养。

1.7转染和慢病毒生产

KLF9siRNA si-KLF9和阴性对照(si-NC)由上海GenePharma公司合成。pcDNA-KLF9和阴性载体(Vector)由湖南Youbio公司构建。通过lipofectamine3000(美国Thermo Fisher Scientific公司)进行细胞转染。

1.8 mtDNA含量的测量

使用TIANamp基因组DNA试剂盒[天根生化科技(北京)有限公司]从U87细胞中提取基因组DNA。使用线粒体16S rRNA基因、tRNA基因和核β2M基因的引物，通过RT-PCR测定相对mtDNA拷贝数。使用qTOWER2.0实时PCR热循环仪(美国Analytik Jena公司)在10μL体积中进行PCR扩增，该体积包含25nmol/L的引物、5μL SYBR Green PCR主混合物和10ng DNA作为模板。引物如下：16S rRNA正向引物为5′-GGTGCAGCCGCTATTAAGG-3′,反向引物为5′-ATCATTTACGGGGAAGGCG-3′;tRNA正向引物为5′-CACCCAGAACAGGGTTTGT-3′,反向引物为5′-TGGCCATGGGTATGTTTA-3′;β2M正向引物为5′-TCGTGTCTCCATGTTTGATGTATCT-3′,反向引物为5′-TCTCTGCTCCCACCTCTAAGT-3′。

1.9细胞活性氧(ROS)测量

采用红色荧光ROS检测试剂盒(苏州优逸兰迪生物科技有限公司)测定细胞ROS。在标准培养条件下，将U87细胞接种在96孔板中。用PBS洗涤细胞后，将细胞与20μmol/L DHE溶液在37℃孵育15min,然后用PBS洗涤细胞2次。使用流式细胞仪监测ROS产生。

1.10定量ATP分析

通过线粒体膜和基质蛋白的降解，可以在生物化学上监测有丝分裂。FCCP是线粒体氧化磷酸化的有效解偶联剂，通常用于诱导线粒体吞噬。将U87细胞分为对照(Con)组、FCCP+si-NC组、FCCP+si-KLF9组。Con组加入空白试剂处理细胞，FCCP+si-NC组、FCCP+si-KLF9组加入FCCP试剂处理细胞。

采用增强型ATP检测试剂盒(上海Beyotime公司)检测细胞ATP水平。在6孔板中培养U87细胞，并用10μmol/L FCCP(美国Sigma公司)处理用si-NC或si-KLF9稳定转染的U87细胞12h。在ATP裂解缓冲液中收获细胞，在4℃下以13 000×g离心5min。收集上清液并转移至新试管中。将20μL上清液和100μL ATP测定工作液加入平底黑色96孔板中。使用光度计微量滴定板读数器监测细胞ATP。

1.11线粒体膜电位(mitochondrial membrane potential, MMP)

根据线粒体膜电位检测试剂盒(美国sigma公司)的使用方法，使用JC-1作为荧光探针快速检测HT22细胞中的MMP。通过荧光显微镜捕获荧光，并使用Image-Pro Plus6.0软件进行数字化。

1.12统计学处理

采用SPSS21.0软件进行数据分析。符合正态分布的定量资料以均数±标准差(x¯±s)表示，采用不成对t检验或单向方差分析。以P<0.05为差异有统计学意义。

2、结 果

2.1 KLF9在GBM中上调并与不良预后的相关性

通过GEPIA平台的数据分析KLF9在低级别胶质母细胞瘤(LGG,WHOⅡ级)和高级别胶质母细胞瘤(GBM,WHOⅢ级或Ⅳ级)中的表达水平。与正常组织相比，KLF9在LGG和GBM肿瘤组织中的表达水平更高(见图1)。总体存活率和无病存活率分析显示，KLF9水平较高的LGG和GBM病人生存期较短(见图2、图3)。此外，GBM表达的KLF9水平明显高于LGG(见图4)。KLF9的高水平与神经胶质瘤病人的低存活率相关，表明KLF9是预后的潜在生物标志物。

图1基于TCGA数据库的GBM和LGG中KLF9的差异表达分析

[红色为肿瘤组织（GBM163例，LCG518例），灰色为正常组织（GBM207例，LCG207例）。TPM为每100万个转录本的数量]

图2LGG和GBM病人的总体存活率分析

图3LGG和GBM病人的无病存活率分析

图4KLF9表达水平和世界卫生组织分级之间的关联

2.2 KLF9蛋白在非癌脑组织和GBM组织中的表达

免疫组织化学染色结果显示，阳性染色的KLF9蛋白有细小的棕黄色颗粒，位于胶质瘤的细胞质中。与非癌脑组织相比，GBM组织中KLF9免疫反应得分显著增加(P<0.05)。详见图5、图6。同时，免疫印迹法证实了GBM组织中KLF9蛋白表达高于非癌脑组织(见图7)。GBM细胞系(U87细胞)和来自GBM病人的N33细胞中的KLF9蛋白表达水平也高于人星形胶质细胞HA中的KLF9蛋白表达水平(见图8)。

图5免疫组织化学染色分析KLF9蛋白表达(×400)

图6免疫组织化学染色分析KLF9免疫反应分得分

图7蛋白印迹分析非癌脑组织和GBM组织中KLF9蛋白表达

图8蛋白印迹分析GBM细胞系(LN229、U87、N33细胞)和人星形胶质细胞HA中KLF9蛋白表达

2.3 GBM病人KLF9表达与临床病理特征的关系

在GBM的GSE16011数据集中，37例KLF9的Z分数≤0(低表达)和71例KLF9的Z分数>0(高表达)。单变量和多变量分析显示，与关键临床特征结合时，KLF9具有显著的GBM预后价值。详见表1。

表1GBM病人的单变量和多变量Cox回归生存分析

2.4 KLF9调节线粒体稳态

KLF9在控制线粒体质量中发挥关键作用，本研究进一步考察KLF9是否也参与调节线粒体稳态。使用KLF9siRNA(si-KLF9)的瞬时转染有效地敲低了U87细胞中内源性KLF9的表达(见图9)。免疫印迹显示，与si-NC相比，si-KLF9降低了U87细胞中线粒体膜蛋白的水平，包括Tim23、Tom20和COXⅣ(见图10)。本研究测定了tRNA和16S rRNA的mtDNA基因的含量，si-KLF9显著减少了mtDNA拷贝数(见图11)。在U87细胞中过表达KLF9,并分析其对线粒体膜蛋白表达的影响(见图12)。然而，免疫印迹显示KLF9过表达对U87细胞中Tim23、Tom20和COXⅣ表达没有明显影响(见图13)。这些结果表明，KLF9可能调节线粒体稳态。

图9qRT-PCR检测si-RNA的敲低效率

（与si-NC比较，*P<0.001)

图10用si-NC或si-KLF9瞬时转染的U87细胞中线粒体膜蛋白的免疫印迹图

图11通过qRT-PCR分析U87细胞中相对mtDNA拷贝数

图12通过qRT-PCR测定KLF9的相对RNA水平

(Vector为阴性载体，与Vector相比，*P<0.001)

图13免疫印迹分析KLF9转染的U87细胞中COXⅣ、Tim23和Tom20的蛋白表达条带图

2.5 KLF9防止线粒体解偶联剂诱导的有丝分裂

免疫印迹显示，si-KLF9对内源性KLF9的敲低促进了FCCP诱导的线粒体内外膜蛋白的降解(见图14)。与Con组相比，FCCP+si-NC组细胞ATP、MMP水平降低(P<0.05),ROS水平增加(P<0.05)。与FCCP+si-NC组相比，FCCP+si-KLF9组细胞ATP、MMP和ROS水平降低(P<0.05)。详见图15～图19。

图14免疫印迹分析细胞中COXⅣ、Tim23和Tom20蛋白表达

图15收集细胞进行ATP分析

图16U87细胞中MMP水平的定量比较

图17U87细胞中的JC-1聚合物(红色)和JC-1单体(绿色)的代表性免疫荧光图像(×200)

图18流式细胞术分析ROS水平效果图

图19U87细胞中ROS水平的定量比较

3、讨 论

本研究发现，KLF9在胶质瘤中表达上调，并与GBM病人的不良预后相关。KLF9是线粒体稳态的负调节因子，KLF9的沉默促进线粒体解偶联剂诱导的线粒体吞噬。线粒体吞噬在控制线粒体稳态中发挥至关重要的作用，线粒体吞噬的损伤导致线粒体功能的下降，是癌症的标志。因此，本研究提出KLF9介导的对线粒体吞噬的抑制可能有助于神经胶质瘤中线粒体稳态的丧失和肿瘤的发展。

近年来，KLFs作为重要的致癌调节因子出现，在不同的细胞背景下作为癌基因和/或肿瘤抑制因子发挥作用[11]。值得注意的是，研究发现KLF9与视网膜神经节细胞中的神经突生长有关[12],表明KLF9在神经癌症中可能具有肿瘤促进作用。然而，KLF9在胶质瘤进展中的作用和机制仍不清楚。本研究证明含有锌指的转录因子KLF9在神经胶质瘤中具有重要的肿瘤诱导作用。首先，本研究发现KLF9在LGG和GBM中均上调，高分级肿瘤组织比低分级肿瘤组织表达更多的KLF9。高水平的KLF9与原发性和复发性胶质瘤病人的低存活率相关，表明KLF9可以作为胶质瘤不良预后的新的生物标志物。此外，本研究观察到KLF9表达在体外培养的细胞系和临床样本中均上调。因此，不仅表明KLF9在神经胶质瘤中作为肿瘤诱导因子发挥作用，而且也支持KLF9失调与人类癌症有关的观点。

mtDNA是一种环状的高拷贝数DNA[8]。除了作为细胞通过氧化磷酸化产生ATP的能量来源，线粒体在钙稳态、脂肪酸氧化、ROS的合成、凋亡、细胞周期和增殖等过程中的作用也至关重要。因此，线粒体活性的破坏与多种疾病有关，包括癌症[6]。此外，mtDNA通过一种称为类核的核蛋白复合物与线粒体内膜相关联[13]。mtDNA突变的累积导致线粒体功能障碍，这在GBM发病机制中起着重要作用，有利于异常的能量和ROS产生以及对凋亡和化疗药物的抵抗[7]。研究发现，KLF9通过增加氧化应激加重心肌细胞缺血性损伤[14]。本研究发现，KLF9敲低降低了U87细胞中线粒体膜蛋白的水平，包括Tim23、Tom20和COXⅣ,并减少了mtDNA拷贝数。这些结果表明，KLF9可能能够调节线粒体稳态。

线粒体体内平衡通过线粒体生物发生和线粒体选择性自噬(线粒体吞噬)的适当平衡来维持[15]。必须去除受损或功能障碍的线粒体以维持线粒体质量和能量供应。线粒体吞噬在清除线粒体和恢复细胞稳态中起着至关重要的作用。线粒体吞噬的失调导致功能障碍的线粒体网络的积累和临床疾病的异质性集合，如癌症和神经退行性疾病[15]。自噬诱导是抗神经胶质瘤治疗的标志性效果之一，通过自噬调节剂靶向线粒体动力学可能是一种潜在的治疗策略[16]。研究报道，自噬相关的基因在神经胶质瘤病人中具有预后潜力，并可能在神经胶质瘤生物学中发挥关键作用[17]。本研究结果显示，KLF9负调节GBM细胞中线粒体稳态和线粒体解偶联剂诱导的线粒体吞噬。KLF9介导对线粒体吞噬的抑制可能有助于神经胶质瘤中线粒体稳态的丧失和肿瘤的发展。

综上所述，本研究使用公开的神经胶质瘤数据库揭示了KLF9在非癌脑组织和脑胶质瘤中表达的差异，特别是在GBM中。高水平的KLF9与GBM病人的低存活率相关。KLF9调节GBM细胞中的线粒体稳态。敲除KLF9降低线粒体膜蛋白水平和mtDNA拷贝数，并促进线粒体解偶联剂诱导的线粒体吞噬。因此，KLF9可作为预测胶质瘤预后的分子标志物，也可作为基因治疗的潜在靶点。

基金资助:湖北省卫生健康委科研计划项目(No.202102325210);

文章来源:黄永锋,朱火灵,张巍.KLF9水平､mtDNA拷贝数与恶性胶质瘤的关系[J].中西医结合心脑血管病杂志,2024,22(17):3241-3247.