首页 > 论文范文 > 医药卫生论文 > 肿瘤科论文 > 脑胶质瘤论文 > 维生素C对IDH1突变胶质瘤细胞凋亡和侵袭的影响

维生素C对IDH1突变胶质瘤细胞凋亡和侵袭的影响

2024-06-25 38 上传者：管理员

摘要：目的探讨维生素C(Vitaminc,VC)对异柠檬酸脱氢酶1(IDH1)突变胶质瘤细胞凋亡和侵袭的影响，评价VC在抗胶质瘤治疗中的应用前景。方法以人胶质瘤U87细胞系为基础，用强力霉素(doxycycline)诱导IDH1突变(dox+组)，未诱导突变为对照组(dox-),Western blot及免疫荧光检测IDH1突变蛋白表达，CCK-8法检测细胞增殖。进行VC(1 mmol•L-1)干预后分为VC干预IDH1突变(dox+VC+)组、无VC干预的IDH1突变(dox+VC-)组、VC干预非IDH1突变(dox-VC+)组、无VC干预的非IDH1突变(doxVC-)组，用Transwell法检测各组细胞侵袭能力，Western blot检测凋亡、侵袭相关蛋白以及应激相关因子表达，CCK-8法检测细胞增殖情况。结果 IDH1突变后dox+组细胞增殖减慢(P<0.05)。VC干预后IDH1突变和非突变胶质瘤细胞的凋亡蛋白Bax、Bad、Cleaved-Caspase-3、Cleaved-PARP表达均上调(P均<0.05)，抗凋亡蛋白Bcl-2及侵袭相关蛋白家族成员基质金属蛋白酶(MMP)-7和MMP-9表达均下降(P均<0.01)，应急保护蛋白p-HSP27表达上调(P<0.01)，细胞侵袭数量降低(P<0.05)。结论 VC促进IDH1突变胶质瘤细胞凋亡，抑制其侵袭。

关键词：
侵袭
凋亡
异柠檬酸脱氢酶1
维生素C
胶质瘤
加入收藏

胶质瘤（glioma,GB）是最常见的颅内恶性肿瘤，占神经系统恶性肿瘤的70%以上[1]。异柠檬酸脱氢酶（isocitrate dehydrogenase,IDH）突变在GB的遗传学特征中占据核心地位[2]，尤其在低级别GB和Ⅱ级胶质母细胞瘤（glioblastoma,GBM）中，IDH1的突变与患者的生存预后密切相关。该突变被认为是一个关键分子标志，通常认为它与存活率和疾病的不同进展模式相关联[3]，其突变导致α-酮戊二酸（α-ketoglutarate,α-KG）转化为D-2-羟基戊二酸（D-2-hydroxyglutarate,D-2-HG），从而竞争性抑制α-KG的活性，阻止DNA及组蛋白的去甲基化[4]，而DNA及组蛋白的甲基化状态是祖细胞分化成熟所必需的[5]。维生素C(vitamin C,VC）又称抗坏血酸，是一种水溶性多羟基化合物，性质活泼，具有很强的还原性[6]。VC作为α-KG依赖性双加氧酶（α-KG dependent dioxygenases,αKGDDs）辅助因子，参与αKGDDs所催化的众多羟基化反应，其涉及DNA去甲基化等各种重要的生物过程[7]。其次，大剂量的VC可能会耗竭细胞内谷胱甘肽，从而导致细胞氧化应激，进而抑制肿瘤的发展[8]。目前VC已应用于胃癌、急性髓性白血病、结直肠癌等恶性肿瘤的临床研究[9]。然而，VC对于IDH突变GB生物学行为的影响尚不明确。本研究利用VC干预IDH突变GB细胞，观察其对肿瘤凋亡、增殖、侵袭等恶性生物学行为的影响，阐明VC抑制GB的相关机制，以期为临床GB的防治提供新思路。

1、材料与方法

1.1细胞株

强力霉素（doxycycline）诱导表达mut IDH1（含IDH1 R132H）的U87细胞由中国人民解放军空军军医大学叶菁教授馈赠，载体基本信息为含IDH1突变蛋白的慢病毒表达载体：Plvx-TightIDH1(R132H，含G418筛选标记），实验体系为doxycycline(10μg·m L-1）诱导表达体系。

1.2试剂

VC购自北京索莱宝科技有限公司；CCK-8试剂盒（C0037）、结晶紫染液和4%多聚甲醛均购自上海碧云天生物技术有限公司；胎牛血清购自威海索尔生物科技有限公司；一抗mut IDH1(8137）、B细胞淋巴瘤/白血病-2(Bcl-2)(4223）、Bcl-2相关X蛋白（Bax)(14796）、Bcl-2相关死亡促进因子（Bad)(9239）、存活蛋白（Survivin)(2808）、磷酸化热休克蛋白27(p-HSP27)(9709）、胱天蛋白酶3(Caspase-3)(14220）、切割型胱天蛋白酶3(Cleaved-Caspase-3)(9664）、聚腺苷酸二磷酸核糖聚合酶（PARP)(9532）、切割型聚腺苷酸二磷酸核糖聚合酶（Cleaved-PARP)(95696）、基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinases,MMP)-7(3801）、MMP-9(15749）均购自美国Cell Signaling Technology公司；抗体GAPDH(AF7021）、辣根过氧化物酶（S0001）标记的羊抗兔IgG二抗（S0001）和曝光液（KF8003）均购自Affinity Biosciences LTD公司。

1.3方法

1.3.1细胞培养

U87细胞在含10%胎牛血清DMEM中培养，置于37℃、5%CO2细胞培养箱中，细胞贴壁后使用doxycycline(10μg·mL-1）诱导表达24 h，随后VC(1 mmol·L-1）干预24 h进行后续实验。实验分为4组：VC干预IDH1突变（dox+VC+）组、无VC干预的IDH1突变（dox+VC-）组、VC干预非IDH1突变（dox-VC+）组、无VC干预的非IDH1突变（dox-VC-）组。

1.3.2 CCK-8检测细胞增殖

按照3×103个/孔的密度将U87细胞接种到96孔板中，边缘孔填充无菌PBS。置于37℃、5%CO2培养箱中，待细胞贴壁后诱导。诱导成功后分别加入1 mmol·L-1浓度的VC培养24、48、72 h。随后，每孔加入CCK-8溶液10μL，继续在37℃下培养2 h，通过酶标仪测量450 nm处的吸光度（OD）值，评估细胞增殖情况。

1.3.3 Western blot

上样等量蛋白（40μg/10μL）用于聚丙烯酰胺凝胶电泳（10%）。80 V电压1.5 h，转膜后PBS清洗3次，每次5 min,10%脱脂牛奶封闭。抗体稀释液稀释一抗[mut IDH1、Bcl-2、Bax、Bad、Survivin、p-HSP27、Caspase-3、Cleaved-Caspase-3、PARP、Cleaved-PARP(1∶1 000）、GAPDH(1∶2 000)]4℃冰箱孵育过夜。复温1.5 h，二抗（1∶3 000）室温孵育1.5 h，曝光液显色，凝胶成像系统曝光，采用Image J进行灰度值测量。

1.3.4 Transwell实验

将基质胶液化，基质胶用不含血清的基础培养基以1∶8的比例稀释，取50μL混合液均匀覆盖在Transwell上室内，待其凝固后加入无血清培养基，下室加入含20%血清培养基培养24 h。弃小室内培养基，棉签擦拭小室内残留细胞，将24孔板内用PBS冲洗2遍，加入4%多聚甲醛，放入小室，固定细胞。PBS洗3次，加入结晶紫染色16 min,PBS再次冲洗3次，显微镜下观察Transwell小室内细胞迁移行为，在镜下随机选取各个方向多部位进行采图，计算各组细胞迁移数量。

1.4统计学方法

采用SPSS 22.0软件对数据进行统计学分析。计量资料以均数±标准差表示，多组间比较采用单因素方差分析，组内两两比较采用LSD-t检验，各独立实验均重复3次。P≤0.05为差异有统计学意义。

2、结果

2.1 IDH1突变抑制GB细胞增殖

Doxycycline诱导U87细胞48 h后免疫荧光显示，IDH1（红色）、dox（绿色）均表达，诱导率高达80%以上。Western blot检测结果及定量分析表明，与dox-组比较，dox+组IDH1突变蛋白表达上调，与dox-VC+组比较，dox+VC+组IDH1突变蛋白表达上调（P均<0.01）。CCK-8检测结果显示，随着时间延长，dox+组细胞增殖减慢（P<0.05）。见图1。

2.2 VC诱导mut IDH1-GB细胞凋亡

CCK-8检测结果显示，随着时间延长，VC干预后细胞增殖减慢（P均<0.05）。Western blot检测结果显示，与dox-组比较，dox-VC+组Bax、Bad、Cleaved-Caspase-3、Cleaved-PARP表达均上调，Bcl-2、Survivin、Caspase-3表达均下降（P均<0.05）。与dox+组比较，dox+VC+组Bax、Bad、Caspase-3、Cleaved-Caspase-3、Cleaved-PARP表达均增加，Bcl-2及Survivin表达均减少（P均<0.01）。见图2。

2.3 VC抑制GB细胞侵袭并改变其应激状态

Transwell实验结果显示，与dox-组比较，dox-VC+组细胞侵袭数量减少，与dox+组比较，dox+VC+组细胞侵袭数量减少（P均<0.05);Western bolt结果显示，与dox-组比较，dox-VC+组MMP-7、MMP-9表达下调，p-HSP27表达升高（P均<0.01）；与dox+组比较，dox+VC+组MMP-7、MMP-9表达下调，p-HSP27表达升高（P均<0.01）。见图3。

3、讨论

GB是成年人中常见的原发性脑肿瘤之一，占恶性脑肿瘤的70%以上[1]。其中GBM是成人中最常见、恶性程度最高的原发性恶性脑肿瘤[10,11]。目前针对GBM遗传或生物学特征的靶向药物疗效并不理想，主要原因之一是不同类型的GB患者存在迥异的遗传学变化，其中IDH突变最为常见[12,13]，其突变阻止了DNA及组蛋白的去甲基化，而DNA和组蛋白的甲基化状态是调整细胞凋亡相关基因表达所必需的[14,15]。以往研究[13]主要集中在细胞毒性和典型的细胞信号传导分子上，很少针对GB的不同表型和分子分类来研究新型的抗GB药物。目前，IDH突变已被视为抗GBM药物筛选的潜在治疗靶点[16,17,18]。本研究结果显示，在诱导IDH1突变后，dox+组细胞增殖明显降低，同时凋亡相关蛋白Bax、Bad、Cleaved-Caspase-3、Cleaved-PARP表达升高，这说明IDH1突变促进细胞凋亡，同时抑制细胞增殖。

图1 IDH1突变抑制GB细胞增殖

A.Doxycycline诱导镜下IDH1荧光表达图（×40);B.IDH1蛋白表达印迹图；C.IDH1蛋白相对表达柱状图；D.CCK-8细胞增殖图；**P<0.01，与dox-组比较aP<0.05。

图2 VC诱导凋亡并抑制mut IDH1-GB细胞增殖

A.CCK-8细胞增殖图；B.Bax、Bad、Bcl-2、Survivin蛋白表达印迹图；C.Bax、Bad、Bcl-2、Survivin蛋白相对表达柱状图；D.Caspase-3、Cleaved-Caspase-3、Cleaved-PARP蛋白表达印迹图；E.Caspase-3、Cleaved-Caspase-3、Cleaved-PARP蛋白相对表达柱状图；*P<0.05,**P<0.01，与dox-组比较aP<0.05，与dox+组比较#P<0.05。

图3 VC抑制GB细胞侵袭并改变其应激状态

A.Transwell实验细胞侵袭图（×40);B.Transwell实验柱状图；C.MMP-7、MMP-9蛋白表达印迹图；D.MMP-7、MMP-9蛋白相对表达柱状图；E.p-HSP27蛋白表达印迹图；F.p-HSP27蛋白相对表达柱状图；*P<0.05,**P<0.01。

VC作为一种水溶性多羟基化合物，可向过渡金属离子（如铁或铜）提供电子，因此成为众多酶的关键辅助因子[19]，其中包括含铜单加氧酶和二价铁离子依赖的αKGDDs。作为αKGDDs的辅助因子，VC参与催化众多羟基化反应，涉及氨基酸的分解代谢和DNA去甲基化等多种重要生物过程[14]，这也是VC在IDH突变GB治疗中的应用前景之一。IDH突变改变了肿瘤细胞的甲基化状态，而甲基化状态改变介导的凋亡相关基因上调可能是肿瘤细胞发生凋亡的重要机制之一[20]。本研究结果显示，在经VC处理后，IDH1突变GB细胞促凋亡蛋白Bax、Bad、Caspase-3、CleavedCaspase-3、Cleaved-PARP表达均上调，同时抗凋亡蛋白Bcl-2及Survivin表达下降，说明VC对IDH1突变GB细胞具有促凋亡作用。VC在抑制细胞增殖和侵袭方面也有效果，经VC处理的dox+VC+组细胞增殖及侵袭均降低，同时，VC还能减少MMP家族成员MMP-7、MMP-9的表达。

在肿瘤治疗中，大剂量的VC可能引起细胞内谷胱甘肽的耗竭从而导致氧化应激的产生，并诱导细胞死亡[8]。同时，VC调节凋亡相关信号通路的表达，如上调Bcl-2、Caspase[21]和p53[22]等蛋白促进肿瘤细胞凋亡。此外，VC通过增强NK细胞活性、促进T细胞增殖和活化提高机体对肿瘤的免疫监视和清除能力[23]。本研究在细胞水平探讨了VC改变IDH1突变的GB细胞凋亡和侵袭的作用，结果显示，VC改变了Caspase和Bcl-2家族相关蛋白的表达，促进了细胞凋亡，从而抑制了IDH1突变的GB细胞的增殖和侵袭。但关于VC对GB细胞的具体作用机制，还需要进一步从表观组学、转录组学等方面进行深入研究。

基金资助:宁夏自然科学基金项目(2022AAC03549);

文章来源:曹瑜,张亚军,杨丽娜,等.维生素C对IDH1突变胶质瘤细胞凋亡和侵袭的影响[J].宁夏医科大学学报,2024,46(06):541-546.