真核生物染色质环拓扑相关结构域(topologically associated domains,TADs)是染色体高级结构的基本组成单位。这种染色质环结构大小不一，使相距较远的相关基因或顺式作用元件在空间上相互靠近，有利于从染色质层面调控基因的表达。近期研究发现，细胞核基质不仅作为染色质TAD结构锚定的平台，而且核基质相关蛋白对染色质TAD结构的空间动态变化具有重要调控作用。

SATB1是一种核基质结合蛋白，最早发现在胸腺细胞和一些祖细胞中大量表达，调控T淋巴细胞的分化和活化(Patta et al.,2020)。然而，SATB1对基因表达的调控不仅局限于T淋巴细胞，其在细胞分化、细胞分裂、细胞凋亡、细胞衰老、肿瘤EMT、肿瘤免疫等事件中都扮演着十分重要的角色。SATB1能够特异性地与富含AT的双链DNA结合，这种DNA序列的碱基倾向于碱基不配对，被称为BURs (Base unpairing region)序列，是一种重要的MARs (Matrix attachment regions)元件(Cai et al.,2006)。哺乳动物细胞内大部分基因的近5'和3'端的100 Kb内以及内含子中都含有BURs序列。研究发现，SATB1可以直接结合到Wnt靶基因的启动子上从而调控Wnt信号通路相关基因的表达(Ramanujam et al.,2021)。SATB1还可以通过与BURs特异结合促使染色质DNA形成染色质环结构与核基质结合，进而作为基因靶向停靠的平台调控大量相关基因的协同表达(Ghosh et al.,2019)。然而，关于SATB1如何在复杂的细胞核结构背景下调控基因表达以及相关的作用分子还未明晰。

1969年，Lane首次发现在细胞核内存在肌动蛋白。肌动蛋白是细胞核基质的重要成分，分布于染色质与染色质之间的空间中，对于基因损伤修复、染色质结构和基因表达至关重要(Kloc et al.,2021)。细胞核肌动蛋白参与基因表达调控主要通过直接与RNA聚合酶Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ形成复合物，调节转录起始复合物的组装和转录的延伸(Wei et al.,2020)，以及作为染色质重塑复合物SWI/SNF、SWR1和INO80的重要组成成分，调节转录因子与DNA的结合，最终调控基因表达(Mahmood et al.,2021;Venit et al.,2021)。还有研究发现细胞核肌动蛋白与SATB1共同调控细胞凋亡相关基因的表达(Grzanka et al.,2014;2015)。然而，关于细胞核肌动蛋白与SATB1之间的作用机制尚不明确。本研究构建His标签融合人β肌动蛋白基因和GST标签融合SATB1基因的原核表达质粒，并在大肠杆菌中进行异源表达，通过体外GST-pull down实验检测二者的相互作用，为进一步在体内研究肌动蛋白与SATB1相互作用机制以及相互作用位点提供科学依据。

1、结果与分析

1.1 p ET32a-his-β-actin和p GEX4T-2-GST-SATB1质粒的构建

利用相应引物以Jurkat细胞提取的c DNA为模板进行PCR扩增获得β-actin和SATB1基因的编码序列，将得到的产物进行1%琼脂糖凝胶电泳检测。β-actin基因PCR产物电泳结果显示在1 000 bp上方有明显条带，与β-actin编码基因(1 128 bp)大小一致(图1A)。在SATB1基因PCR产物电泳结果中可以看出在2 000 bp上方有明显条带，与SATB1编码基因(2 292 bp)大小一致(图1B)。

用HindⅢ/Bam HⅠ对p ET32a载体和目的基因β-actin进行双酶切，用Eco RⅠ/Bam HⅠ对p GEX4T-2载体和目的基因SATB1进行双酶切，将酶切后的目的基因和载体进行琼脂糖凝胶回收。接下来，将酶切后p ET32a载体与β-actin目的片段，p GEX4T-2载体与SATB1目的片段进行连接，将连接产物进行转化到大肠埃希菌DH5α后，37℃恒温过夜培养。挑取白色单菌落，进行扩大培养后提取重组质粒并进行1%琼脂糖凝胶电泳。p ET32a-his-β-actin重组质粒电泳结果显示，在5 000 bp左右处可以看到明显的电泳条带，与His-β-actin重组质粒大小接近(图2A)。另外，p GEX4T-2-GST-SATB1重组质粒电泳结果显示在5 000～7 500 bp处有明显条带，与GST-SATB1重组质粒大小接近(图2B)。

1.2 p ET32a-his-β-actin和p GEX4T-2-GST-SATB1质粒的鉴定

利用相应的限制性内切酶对His-β-actin和GST-SATB1重组质粒进行双酶切验证。从琼脂糖凝胶电泳结果中可以看出，p ET32a-his-β-actin酶切后出现两条亮带，一条在5 000 bp上面与p ET32a载体大小一致，一条位于1 000 bp与β-actin编码基因大小一致(图3A)。p GEX4T-2-GST-SATB1酶切产物电泳结果显示p GEX4T-2-GST-SATB1酶切后出现两条亮带，一条位于5 000～7 000 bp之间，与p GEX4T-2载体大小一致，另外一条位于2 500 bp左右，与SATB1编码基因的大小接近(图3B)。由此表明，His-β-actin和GST-SATB1重组质粒连接成功。

为了进一步验证重组质粒插入序列是否有突变发生，本研究将p ET32a-his-β-actin和p GEX4T-2-GST-SATB1质粒的插入片段进行DNA测序鉴定。通过软件将测序序列在Gen Bank中进行对比，比对结果一致性为100%。以上结果说明p ET32a-his-β-actin和p GEX4T-2-GST-SATB1重组质粒成功构建且并未发生基因突变。

1.3融合蛋白His-β-actin和GST-SATB1的表达与鉴定

本研究将重组质粒p ET32a-his-β-actin和p GE-X4T-2-GST-SATB1转化到大肠埃希菌BL21 (DE3)中检测目的蛋白的表达情况。经IPTG诱导后收集菌体进行超声破碎，收集上清液进行免疫印记。实验结果显示，转入p ET32a-his-β-actin质粒的菌液经过IPTG诱导后在分子量40～55 k D有明显蛋白条带，与His-β-actin融合蛋白(～48 k D)分子量接近(图4A)。转入p GEX4T-2-GST-SATB1质粒的菌液上清液中在100～130 k D之间有明显蛋白条带，和GST-SATB1融合蛋白(～110 k D)分子量接近。转入p GEX4T-2-GST空载质粒的菌液中在25 k D处有明显GST标签蛋白条带(图4B)。结果表明，His-β-actin和GST-SA-TB1在大肠埃希菌中诱导表达成功，且大部分为可溶性表达。 

1.4融合蛋白His-β-actin和GST-SATB1相互作用分析

为了分析肌动蛋白与SATB1的体外结合情况，本研究利用谷胱甘肽-凝胶4B珠子亲和层析方法对GST-SATB1和GST标签蛋白进行富集和纯化。然后，将纯化的蛋白与IPTG诱导后的表达His-β-actin菌液上清液进行孵育，再通过免疫印记观察二者结合情况。实验结果显示，His-β-actin能够与GST-SA-TB1结合，而不能与GST结合(图5)。由此可以看出，β-actin与SATB1能够在体外条件下结合，二者存在相互作用。

2、讨论

作为染色质结构组织者，SATB1在个体发育和肿瘤发生的基因表达调控中扮演重要角色。SATB1与染色质DNA的结合受到许多因子的调控。已有研究发现，蛋白激酶C (PKC)可以使SATB1的PDZ结构域磷酸化，磷酸化的SATB1与HDAC1结合能力增强抑制基因的表达。当SATB1去磷酸化后，其与PCAF/P300结合增强，SATB1被乙酰化修饰后与DNA脱离，从而解除抑制作用促进基因的表达(Kumar et al.,2006;Purbey et al.,2009)。此外，SATB1的苏素化和泛素化也可以影响其对靶基因的调控(Tan et al.,2010;Yu et al.,2019)。近年来，越来越多的研究关注于细胞核基质中亚细胞核成分对SATB1功能的调控作用。转录因子PU.1调控SATB1与染色质的结合进而影响T细胞早期分化基因的表达谱(Hosokawa et al.,2018)。在Th2细胞分化过程中，RHS6 (Rad50 hypersensitive site 6)通过调节SATB1介导的染色质环与核基质的结合影响IL-4、IL-5和IL-13基因簇的表达(Hwang et al.,2017)。组成亚细胞核结构PML小体的PML蛋白通过与SATB1直接相互作用调控MHC I基因簇染色质环的动态变化，最终影响MHC I基因簇的表达(Kumar et al.,2007)。然而，关于SATB1功能的调控机制尚未完全清楚。

随着高分辨率显微镜和染色质Hi-C技术发展，越来越多证据表明分布于细胞核基质内的肌动蛋白对染色质结构变化和基因表达具有重要作用。肌动蛋白通过与β-catenin结合调节Wnt/β-catenin靶基因的表达，而且肌动蛋白参与核膜附近异染色质组装和相关基因的表达调控(Plessner and Grosse,2019;Shindo et al.,2021)。肌动蛋白还可以与SATB1共同调控细胞凋亡相关基因的表达(Grzanka et al.,2014;2015)。然而，肌动蛋白与SATB1的相互作用机制仍未明确。本研究构建了p ET32a-his-β-actin和p GE-X4T-2-GST-SATB1的原核表达质粒，通过在大肠埃希菌中进行异源表达和蛋白纯化后，利用体外蛋白质pulldown实验分析β-actin和SATB1的相互作用。这样就排除了细胞内复杂环境以及其他成分的影响。实验结果表明，在体外β-actin能够与SATB1相互结合，提示β-actin可能通过与SATB1直接相互作用进而调节SATB1的功能，为进一步分析二者在基因表达调控中的作用机制提供理论基础。

3、材料与方法

3.1试验材料

人T淋巴细胞瘤细胞Jurkat细胞由本实验室冻存。p ET32a和p GEX4T-2原核表达载体由本实验室保存。大肠埃希菌(Escherichia coli) DH5α和BL21(DE3)感受态细胞购自生工生物工程(上海)股份有限公司。Eco RⅠ、Bam HⅠ和HindⅢ限制性内切酶购自日本Ta Ka Ra公司，T4连接酶购自Thermo生物公司，质粒提取和回收试剂盒购自天根生物公司，His和GST标签抗体购自Gentex公司，异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)和考马斯亮蓝购自生工生物工程(上海)股份有限公司。胰蛋白胨、琼脂糖、酵母提取物、Na Cl、Zn SO4、琼脂粉、氨苄青霉素、乙醇、甘油、氯仿、异丙醇等购自鼎国生物公司。

3.2目的基因的获得

根据肌动蛋白基因序列和p ET32a载体特点设计肌动蛋白的上游引物为ATGGATGATGATATCG CCGCGCT，下游引物为TAGAAGCATTTGCGGT GG，两端加上HindⅢ和Bam HⅠ酶切位点。根据SATB1基因序列和p GEX-4T-2载体特点设计SATB1扩增的上游引物为CCATGGATCATTTGAA CGAGG，下游引物为GTCAGTCTTTCAAATCAGT ATTAA，两端加上Eco RⅠ和Bam HⅠ酶切位点。以Jurkat细胞c DNA为模板进行PCR反应。50μL反应体系。PCR反应条件为：98℃预变性5 min;98℃10 s,64℃15 s,72℃1～2 min，共30个循环；72℃2 min。

3.3重组质粒的构建和鉴定

使用限制性核酸内切酶Eco RⅠ、Bam HⅠ分别双酶切SATB1目的基因和p GEX-4T-2载体；用HindⅢ和Bam HⅠ双酶切β-actin和载体p ET32a。将目的片段与载体按照3∶1比例进行连接。将上述连接的10μL的连接子转化入100μL的DH5α感受态细胞，加入700μL无抗性LB液体培养基，37℃，160～225 r/min摇床培养1 h。取出200μL涂布于含有相应抗性的LB培养基平板上，倒置培养基，37℃温箱培养12～16 h。挑取白色单菌落扩大培养后进行质粒的提取、双酶切和测序鉴定。

3.4 His-β-actin和GST-SATB1的诱导表达与纯化

将两种构建好的质粒及空载质粒转入大肠埃希菌BL21 (DE3)中，在氨苄抗性的LB平板培养过夜。挑取单菌落于氨苄抗性的LB培养基中37℃培养过夜。按照菌液与培养基1∶7比例继续震荡培养1 h。然后加入16μL的100 mmol/L IPTG和16μL Zn SO4继续培养3～4 h进行蛋白诱导表达。结束后4 000 r/min离心10 min，收集菌体沉淀进行超声破碎，将破碎液12 000 r/min离心20 min后收集上清液，取一部分上清液加入上样缓冲液，沸水煮样5 min后进行SDS-page和蛋白质免疫印迹检测蛋白表达情况。

3.5 GST pull-down实验

将转入GST-SATB1和GST空载质粒的菌液分别进行超声后，收集上清液并与谷胱甘肽-凝胶4B珠子4℃孵育4 h或过夜，然后用NETN和TEN100裂解液漂洗4B珠子，去除非特异性结合。将诱导表达后的His-β-actin菌液进行超声后，离心收集上清液备用。将结合有GST-SATB1的谷胱甘肽-凝胶4B与His-β-actin上清液4℃孵育过夜，然后用NETN裂解液漂洗4B珠。加入上样缓冲液煮样后，进行SDS-PAGE和蛋白质免疫印迹实验。

作者贡献：

齐文靖是本研究的实验设计者和实验研究的执行人；鄂明菊完成数据分析，论文初稿的写作；卜庆盼参与实验设计，试验结果分析；韩德复是项目的构思者及负责人，指导实验设计、数据分析、论文写作与修改。全体作者都阅读并同意最终的文本。

文章来源:齐文靖,鄂明菊,卜庆盼等.SATB1与肌动蛋白基因的异源表达与体外相互作用[J].分子植物育种,2023,21(17):5671-5676.DOI:10.13271/j.mpb.021.005671.

基金资助：吉林省教育厅项目(JJKH20200825KJ；JJKH20220833KJ)； 吉林省科技厅项目(YDZJ202201ZYTS661)； 长春师范大学自然科学项目(长师大自科合字[2019]第017号)共同资助.