当奶牛处于围产期时，脂肪过度堆积在临床上会表现为食欲不振、机体衰弱、显著减产，进而导致高酮血症、脂肪肝等代谢性疾病[1]。在一定程度上，哺乳动物的体脂沉积就是脂类的不断积累，主要表现为前脂肪细胞在脂肪组织中发生增殖、分化及生长肥大。而此过程又受到许多外在因素的调控，因此前脂肪细胞增殖和分化的影响因素与脂肪的形成密切相关[2]。尽管已有研究表明，体脂沉积与奶牛饮食所诱导的正常脂肪发育密切相关[3]，但目前对调节牛前脂肪细胞增殖及分化的细胞和分子机制知之甚少。

丙酸（propionic acid,PA），又称初油酸，是厌氧结肠微生物群发酵膳食纤维产生的主要代谢产物。PA在反刍动物体内具有调节能量平衡和抗生酮作用，同时PA作为主要前体物质，在糖原异生中也发挥着举足轻重的作用[4]。丙酸钙是一种非常普遍的青贮饲料添加剂，在动物体内可以水解分为PA和Ca2+，从而使膜内电化学梯度发生变化，破坏运输过程，并抑制磷酸盐和氨基酸等底物分子的摄取[5]。在奶牛养殖过程中，饲料里添加一定剂量的丙酸钙、PA和丙二醇等饲料添加剂可以减缓酮病的发展[6]，在动物饲料中添加适量的丙酸钙也可以促进葡萄糖和胰岛素的生成，抑制血液中游离脂肪酸的产生[7]。

PA在瘤胃酸性条件下形成，被瘤胃上皮吸收后，通过门静脉进入肝脏，合成葡萄糖[8]。清除奶牛肝细胞内的PA可使肝细胞葡萄糖的释放达到60%，这表明PA作为瘤胃发酵的产物之一，极有可能也参与调控脂肪沉积[9]。PA可能通过提高脂肪生成改变脂肪组织功能，同时增加成脂分化相关基因的表达，减弱细胞内脂肪分解[10]，并减少促炎细胞因子和其他几种趋化因子的释放[11]。同时PA被用作一种现成的能量来源，以纠正奶牛的代谢问题[12]。PA还可促进奶牛犊牛瘤胃上皮细胞发育，促进犊牛生长[13]。PA的这些分子机制是否与牛前脂肪细胞的增殖和分化具有生物学相关性尚不清楚。

PA作为短链脂肪酸（short chain fatty acids,SC-FAs）中最具代表性的一种，除被认为是肠上皮细胞中的重要能量来源外，也具有调节特性，可以影响宿主代谢，免疫稳态，细胞增殖分化等[14]。PA能通过降低细胞内脂肪分解，增加脂肪生成，从而改善脂肪组织的脂质缓冲能力，降低脂肪组织中促炎细胞因子及趋化因子的分泌[15]。研究意在明确PA对牛前脂肪细胞增殖及分化的影响，为后续深入研究牛脂肪组织的正常发育和体脂沉积提供理论基础。

1、材料与方法

1.1 主要试剂

试验所用PA(S817368）购自Macklin公司；DME/F12培养基（SH30023.01）购自HyClone公司；CCND1(ab226977）、CCND2(ab230883）、CCND3(ab155682）、CCNE1 (ab155682）、CDK2(ab235941）、CDK4(ab137675）、CDK6(ab151247）、Ki67(ab15580）等一抗购自Abcam公司；PPARγ(16643-1-AP）、C/EBPα(18311-1-AP）、SREBF1(14088-1-AP）及HRP标记二抗（SA00001-1、SA00001-2）等抗体购自Proteintech公司；EdU细胞增殖检测试剂盒（C0071S）购自Beyotime生物技术公司。

1.2 牛前脂肪细胞培养

根据先前发表使用的方法分离健康奶牛前脂肪细胞[16]。用I型胶原酶溶液（1 mg·mL-1,Sigma）消化脂肪组织，随后使用40μm细胞过滤器过滤脂肪组织，分离牛原代前脂肪细胞与基质血管细胞。将基质血管细胞（SV）以800×g室温离心10 min，弃上清分离原代前脂肪细胞。随后用ACK红细胞裂解缓冲液清理掉混在SV细胞中的红细胞，再次在室温下以800×g离心10 min。前脂肪细胞通过SV细胞在T25细胞培养瓶中贴壁生长，连续传代2次后获得。前脂肪细胞培养在6孔板中，当达到70%～80%汇合后将细胞分为对照组和PA处理组，对照组正常培养，处理组使用不同浓度PA(0.1～3 mmol·L-1）以及不同时间（12～48 h）处理细胞。

1.3 油红O染色

细胞经PA处理完毕后，向成熟的脂肪细胞中加入多聚甲醛（浓度为4%）固定细胞。随后用PBS清洗去除残余固定液，向细胞中加入油红O稀释液染色40 min，再次用PBS洗涤，使用异丙醇（浓度为60%）脱色30 s。脱色完成后迅速弃去异丙醇，使用PBS漂洗。加入苏木精染料对细胞核染色1 min，用PBS洗去残留的苏木精染料。处理完毕后在光学显微镜下观察细胞的形态变化以及染色的脂质，对染色结果进行拍照。

1.4 细胞增殖分析

按照EdU细胞增殖检测试剂盒说明书所述，检测牛前脂肪细胞的增殖活性。接种细胞于6孔板，贴壁后向细胞中加入PA处理48 h,PA浓度为0.1 mmol·L-1。随后向细胞中加入EdU试剂，每孔20μL,37℃孵育2 h。EdU标记完成后固定细胞15 min、通透液孵育15 min、Click反应液避光孵育30 min、1X Hoechst 33342避光孵育10 min，每次处理完后均使用PBS清洗细胞。流式细胞仪测定细胞悬液中的增殖情况。

1.5 细胞周期分析

于6孔板中培养细胞，待其贴壁稳定生长后，向细胞中加入0.1 mmol·L-1PA处理48 h。处理后细胞通过EDTA-胰蛋白酶消化，1 000 rpm离心5 min，将细胞洗涤2次。放置在4℃乙醇（浓度为70%）中孵育固定12 h，洗涤2次，小心吸除上清液，并将细胞在PI/RNase染色缓冲液（BD Biosciences）中室温染色0.2 h。用流式细胞仪分析染色的细胞。

1.6 Western Blot

在获得细胞总蛋白后，蛋白质浓度使用酶标仪进行测定。蛋白样品和上样缓冲液均匀混合，水浴加热10 min。等量的蛋白质在SDS-PAGE凝胶（浓度为10%）中电泳分离，随后电转到聚偏二氟乙烯膜上，5%牛奶封闭2 h，加入一抗（稀释比例1∶10 000）特异性结合，4℃过夜，然后用TBST洗涤30 min。室温下加入二抗（稀释比例1∶10 000）孵育40 min,TBST清洗30 min。膜使用AI600成像仪获取图像。使用Image J软件定量蛋白质条带。

1.7 数据统计分析

试验所有数据均采用单因素方差分析（One-way ANOVA），数据呈现均采用均值±标准差形式表示。当P<0.05时，数据被认为有显著性，P<0.01为具有极显著性差异。所有数据处理所用软件为Graphpad Prism 8.0。

2、结果与分析

2.1 不同浓度及时间PA对牛前脂肪细胞的影响

为确定不同浓度及不同时间的PA对牛前脂肪细胞的影响，用0.1～3 mmol·L-1PA处理原代牛脂肪细胞12～48 h。结果表明，0.1与1 mmol·L-1PA刺激组中分化相关指标—PPARγ和C/EBPα的蛋白表达水平显著高于对照组（图1）。而且在0.1 mmol·L-1PA处理48 h时，PPARγ和C/EBPα的蛋白表达水平达到峰值。故后续试验均采用0.1 mmol·L-148 h来处理牛前脂肪细胞。

图1 不同浓度及时间PA对牛前脂肪细胞的影响

2.2 PA对牛前脂肪细胞脂滴生成的影响

油红O染色结果表明，PA组的细胞由梭状转化为圆形，且出现明显的被染成红色的脂质生成，说明PA处理后，前脂肪细胞的脂滴生成明显增多（图2）。

2.3 PA对牛前脂肪细胞增殖活性的影响

EdU与细胞增殖标志物Ki67的蛋白结果表明，与对照组细胞相比，添加PA处理后，荧光显微镜下可见明显的红色荧光；Ki67的蛋白表达量明显升高，这些均说明牛前脂肪细胞的增殖活性显著升高（图3）。

图2 PA对牛前脂肪细胞脂滴生成的影响

图3 PA对牛前脂肪细胞增殖的影响  

2.4 PA对牛前脂肪细胞增殖进程的影响

结果显示，PA能够增加牛前脂肪细胞中S期的比例，并升高了处于G2期的比例（图4），说明PA处理能够升高牛前脂肪细胞增殖作用。

图4 PA对牛前脂肪细胞增殖进程的影响

2.5 PA对牛前脂肪细胞的细胞周期的影响

分别检测了细胞周期相关蛋白CCND1、CCND2、CCND3、CCNE1以及CDK2、CDK4、CDK6的蛋白表达情况。结果表明，PA处理能够显著升高以上蛋白的蛋白表达水平（图5）。这说明PA处理能够推进牛前脂肪细胞从G1期到S期的转变，从而加速了细胞周期的进程。

图5 PA对牛前脂肪细胞周期蛋白的影响

图6 PA对牛前脂肪细胞分化相关蛋白的影响

2.6 PA对牛前脂肪细胞分化的影响

试验检测PA对牛前脂肪细胞分化水平的影响。与对照组相比，添加PA的脂肪细胞中分化相关指标PPARγ、C/EBPα和SREBF1蛋白表达水平均显著升高，表明PA能够促进牛前脂肪细胞的分化，如图6所示。

3、讨论

产犊后，处于过渡期的奶牛会受到各种生理应激冲击，导致干物质摄入量低、激素变化和高发病率[17]。特别是在高性能奶牛中，采食量的减少使其无法满足快速产奶的需求，此时奶牛体内脂肪动员增强、机体生糖物质不足、氨基酸消耗增多[18]，从而导致能量负平衡（negative energy balance,NEB）的发生。为应对这种情况以及适应母乳喂养的要求，奶牛开始加快新陈代谢，增加脂肪沉积和酮体生成[19]，这导致了以高酮血症为主要临床特征的糖脂代谢性疾病的发生[20,21,22]。此外，奶牛在NEB状态下还会产生大量的活性氧和脂质过氧化物，处于氧化应激状态。当氧化应激程度超过体内抗氧化系统的清除能力时，氧化系统和抗氧化系统发生失衡，从而导致组织损伤，产生免疫抑制，进而导致代谢性疾病的发生，如乳腺炎、子宫炎等[23]。

在NEB期间，脂肪组织（adipose tissue,AT）中高需求的脂肪分解率与疾病易感性增加和泌乳性能受限有关。脂肪分解诱导AT的重塑过程，其特征为炎症反应、细胞增殖和细胞外基质（extracellular matrix,ECM）的改变。然而AT内前脂肪细胞分化加剧会引起成熟脂肪细胞数目增加，进而导致肥胖的形成，从而增加许多疾病的发病风险。脂肪过多堆积，脂肪细胞肥大，进而引发肥胖、胰岛素抵抗，引起纤维化及炎症等[24]，这些是脂肪细胞增殖和分化异常所导致的结果，这些结果会加速代谢性疾病的发生和发展，如心血管疾病、某些类型的癌症和2型糖尿病[25]。

PA是结肠中的特定厌氧细菌进行膳食纤维发酵产生的代谢物之一，在人体和动物体内可降低肝脏和血浆中脂肪酸的产生和数量，改善组织胰岛素敏感性[26]。脂肪酸水平的降低还可能是因为PA能抑制脂肪细胞的脂肪分解[27]及诱导脂肪生成[28]。与野生型小鼠相比，PA受体（GPCR41）缺乏的小鼠会表现出更少的脂肪[29]。此外，PA可诱导猪[27]、小鼠[30]和反刍动物[31]脂肪组织产生肥胖标志物瘦素（leptin）等。PA对结肠肿瘤细胞、猪肌内前脂肪细胞[27]、小鼠[30]前脂肪细胞增殖和分化的影响已经得到充分证实。

细胞增殖依赖于细胞周期的几个阶段（G0～G1、S、G2和M),G1至S阶段主要由几个周期蛋白依赖性激酶的连续激活调节。这些蛋白以细胞周期特定阶段的方式表达活性，如CDK4和CDK6是细胞周期通过G1阶段进行的关键介质，也是必要条件[32]，在哺乳动物发育和癌症中起关键作用。而CDK2在G1晚期和S期活跃，参与DNA合成、G1/S期转变和G2进程的调节，对调节细胞的自我更新[33]和细胞分化[34]等生理过程起着关键性作用。在目前的研究中，PA促进细胞周期从G1到S期的转变以及CCND1、CC-ND2、CCND3、CCNE1、CDK2、CDK4、CDK6丰度的升高，这些均表明PA促进了牛前脂肪细胞增殖。

脂肪细胞的数量多少被认为是前脂肪细胞增殖及其随后分化为成熟脂肪细胞的结果。脂肪细胞增殖分化包括以下一系列过程：细胞周期阻滞、有丝分裂克隆扩增、有丝分裂后生长阻滞和最终分化，这些过程需要复杂且严格调控的转录因子[35,36,37]。前脂肪细胞的增殖和分化都以转录和翻译后反应模式的显著变化为特征，在此过程中触发了一系列转录因子，参与控制了脂肪形成基因的表达[38,39]，前脂肪细胞脂滴积聚增多，最终形成成熟脂肪细胞。在前脂肪细胞成脂分化早期时，C/EBPβ首先被激活，进而诱导PPARγ和C/EBPα表达升高[40]，且二者之间相互作用，形成正反馈环路，积极维持分化状态[41]。SREBF1可与PPARγ协同合作，参与脂质代谢的调节，增加其转录活性，调控脂肪生成[42]及脂肪细胞的分化[43]。试验结果显示，PA上调了牛前脂肪细胞中分化指标PPARγ、C/EBPα以及SREBF1的表达，这与在3T3-L1脂肪细胞中观察到的结果一致[44,45]，进一步说明PA可以促进牛前脂肪细胞的分化。因此，现有数据表明PA可能对脂肪生成及发育产生重要影响。

综上所述，试验在细胞水平上探讨PA影响牛前脂肪细胞增殖及分化的机制，证实作为肠道微生物代谢产物之一的PA可以促进牛前脂肪细胞的增殖及分化。这提示在寻找治疗人和动物体脂沉积的方法时，可以从肠道微生物代谢产物方面着手，为其正常发育提供理想模型。

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基金资助:国家自然科学基金项目(32102743,32125038); 黑龙江八一农垦大学引进人才科研启动基金项目(XYB202105);

文章来源:郑晰丹,范云珲,杨童,等.丙酸对牛前脂肪细胞增殖及分化的影响[J].黑龙江八一农垦大学学报,2024,36(03):31-37.