原发性开角型青光眼(primary open angle glaucoma, POAG)是一种以房角开放、眼压进行性升高、视网膜神经节细胞(retinal ganglion cell, RGC)进行性变性、视野缺失为特征的慢性进展性眼病[1]。POAG早期发病隐匿，直到疾病晚期因出现视野缺损而就诊，目前已经成为致盲性眼病最常见的原因之一。POAG好发于40-80岁人群，是常见的青光眼类型，亚洲POAG发病率占全球的近50%,并且其发病率呈逐年上升趋势[2]。目前为止，POAG的发病机制尚不完全清楚，可能的致病因素尚不明确。肠道菌群(gut microbiota, GM)是肠道微生态系统中主要的活性成分，其作为人体内重要的微生态系统，对于外界信号反应产生相应的变化，年龄和不健康因素等因素会导致GM主要组成发生变化或功能发生异常，改变免疫环境和代谢产物，包括丁酸和短链脂肪酸，从而引起一系列疾病的发生发展[3]。研究表明[4-7]肠道菌群失调参与了POAG、糖尿病视网膜病变(diabetic retinopathy, DR)、年龄相关性黄斑变性(age-related macular degeneration, ARMD)等眼部疾病的发生发展。随着GM在神经退行性病变研究的深入，有学者提出“微生物-肠-眼轴(microbiome-gut-eye axis)”的相关理论，认为GM在人体视网膜及视神经疾病发生发展中发挥重要作用，且研究结果表明GM通过调控宿主免疫参与眼部疾病发生发展的结论，同时为其他自身反应性疾病的发病机制提供新的研究方向[8]。但是上述研究可能存在偏倚或是混杂因素的影响，从而导致结论的不准确。但是临床研究可能存在选择偏倚、信息偏倚、混杂偏移的影响以及样本量较少和花费较高的限制[9-10],进一步导致结论的不准确。孟德尔随机化(Mendelian randomization, MR)的研究所使用数据大多数基于已公开发表的全基因组关联研究数据(genome-wide association studies, GWAS),使用遗传变异作工具变量(instrumental variables, IVs),免受混杂因素的影响，测量差异较小、样本量较大、因果关系明确、更容易实现[11-12]。因此在本文中，我们通过两样本MR的研究方法，使用GWAS的公共数据作为IVs,识别GM与POAG潜在的因果关系。

1、对象和方法

1.1对象

POAG的数据来自于Integrative Epidemiology Unit(IEU)Open GWAS数据库(https: //gwas.mrcieu.ac.uk)中GWAS公共可用数据(finn-b-H7_GLAUCPRIMOPEN),纳入结局POAG公共数据集，总样本量214 634例，其中包括4 433例POAG患者，210 201例对照组，共计16 380 455个单核苷酸多样性(Single Nucleotide Polymorphisms, SNPs),见表1。该数据集中的数据均来源于欧洲人群。GM数据来自于英国布里斯托尔大学的GWAS数据库，这项研究分析了来自24个队列的18 340名参与者。该研究包含从属到门级别共计196个GM分类群，其中与GM遗传变异相关联的有9个门、16个纲、20个目、35个科和119个属，排除了15个未命名的GM。MR分析流程图见图1。

1.2方法

1.2.1工具变量的筛选

首先满足相关性假设：IVs的遗传变异与GM暴露因素具有显著相关。本研究通过GWAS数据集在全基因组水平上确定与POAG相关的SNPs,即达到统计意义阈值结果(P<1×10-5)。然后，通过设置连续不平衡(linkage disequilibrium, LD)聚类即R2<0.001,等位基因距离>10 000 kb,为标准获取暴露的独立SNPs。通过设置IVs的F值>10,避免弱IVs所引起的偏差，其中F统计量的公式是为满足第二、三MR假设，我们使用PhenoScanner V2(http: //www.phenoscanner.medschl.cam.ac.uk/)数据库分别去除同时与POAG相关的混杂因素(如高血压、收缩压、舒张压、2型糖尿病、情绪紧张、高度近视等)的IVs。此外，为了协调数据，本研究删除等位基因频率的回文SNPs。本研究筛选的工具变量需要满足以下3个条件：(1)遗传工具可预测目标暴露(P<1×10-5);(2)遗传工具与混杂因素无关；(3)遗传工具与结局变量无关，仅通过目标暴露影响结局。

1.2.2 MR分析方法

采用Wald比值(WR)方法对单个SNP进行因果估计分析。通过对暴露和结局的Beta值、SE值采用逆方差加权(IVW)、MR Egger、加权中位数(WM)、Simple Mode、Weighted Mode等方法并结合森林图分析POAG与GM存在的潜在关系。其中，IVW方法能够提供最为准确的效应估计值，因此IVW法比其他方法检验效能更好，所以本研究采用IVW法作为主要的分析方法。当P≥0.05时，证明POAG暴露因素与GM结果之间不存在因果关系；当P<0.05时，证明POAG暴露因素与GM结果之间存在显著的因果关系。

1.2.3敏感性分析

为了研究单个SNP驱动因果关联中所起到的作用，我们通过留一法进行探究。即通过逐个剔除某个工具变量来评估每一个SNP的综合影响。其次，对暴露和结局的Beta值、SE值、SE值使用MR Egger回归和MR-PRESSO检验，以检测MR分析结果是否存在水平多效性，P≥0.05认为以上的MR的分析结果不存在水平多效性。若MR-PRESSO结果存在P<0.05的情况，则剔除相应的SNPs重新进行MR分析。最后，对暴露和结局的Beta值、SE值进行Cochran'sQ检验，以检测MR分析结果是否存在异质性。Cochran'sQ检验的P≥0.05时表明以上的MR因果分析不存在异质性，P<0.05时表明以上的MR因果分析不存在异质性。

统计学分析：采用R软件(4.3.1)中的MRInstruments、plyr、dplyr、data.table、TwoSampleMR、ieugwasr、plinkbinr、MR-PRESSO、forestmodel、forestploter等R包进行统计分析。P<0.05为差异有统计学意义。

图1 MR分析流程图。

2、结果

2.1 MR结果分析

对196种GM进行聚类，共有2 213个独立的SNPs与GM相关，其中包括门、纲、目、科和属5个分类水平。经过一系列的质控步骤，筛选出119个IVs进行MR研究。其中，所有筛选出的SNPs的统计量F均>10。其中Streptococcaceae包含17个SNPs, Butyrivibrio、Candidatus Soleaferrea、LachnospiraceaeUCG001各包含16个SNPs, Oxalobacteraceae和RuminococcaceaeUCG013各包含15个SNPs, Ruminococcustorquesgroup包含13个SNPs, Howardella包含11个SNPs。IVW分析显示，共发现8种GM与POAG存在关联，其中Butyrivibrio(OR=1.170,95%CI:1.057-1.295,P=0.002)、Howardella(OR=1.188,95%CI:1.043-1.355,P=0.010)、LachnospiraceaeUCG001(OR=1.229,95%CI:1.016-1.485,P=0.033)、Streptococcaceae(OR=1.330,95%CI:1.020-1.734,P=0.035)与POAG的发病存在一定的联系，增加了POAG的发病风险，与POAG的发病呈正相关；而RuminococcaceaeUCG013(OR=0.772,95%CI:0.601-0.991,P=0.042)、Candidatus Soleaferrea(OR=0.773,95%CI:0.647-0.923,P=0.005)、Ruminococcustorquesgroup(OR=0.631,95%CI:0.440-0.905,P=0.012)和Oxalobacteraceae(OR=0.833,95%CI:0.704-0.986,P=0.034)可能降低了POAG的发病风险，与POAG的发病呈负相关。在该项研究中，我们使用PhenoScanner V2网站查询与8种肠道菌群相关的SNPs以排除混杂因素的影响以及使用MR-PRESSO分析方法排除水平多效性的影响。根据查询结果发现有5个SNPs跟混杂因素高血压、收缩压、舒张压、2型糖尿病和焦虑相关，见表1。

根据MR-PRESSO分析结果可得知Ruminococcustorquesgroup和Oxalobacteraceae的MR-PRESSO的P<0.05。因此将这些SNP排除后重新进行MR分析。重新计算的结果显示，在IVW方法中，Candidatus Soleaferrea(OR=0.810,95%CI:0.670-0.981,P=0.031)、Ruminococcustorquesgroup(OR=0.656,95%CI:0.453-0.950,P=0.026)、RuminococcaceaeUCG013(OR=0.770,95%CI:0.598-0.990,P=0.042)均降低了POAG的发病风险，与POAG的发病呈负相关。而Streptococcaceae、Oxalobacteraceae在分别去除rs2952251、rs111966731后，与POAG的发病不相关(P>0.05)。通过MR Egger、Weighted median、IVW、Simple mode、Weighted mode分析方法对GM与POAG因果关系的分析见图2。同样散点图分析也证明了上述结果(图3)。

表1肠道菌群的工具变量中具有潜在多效性的SNPs

图2与POAG存在因果联系的GM效应森林图。

2.2敏感性分析

SNPs与结局POAG的水平多效性通过MR Egger回归予以进一步分析验证。该结果显示Butyrivibrio(P=0.679)、Howardella(P=0.708)、LachnospiraceaeUCG001(P=0.793)、Candidatus Soleaferrea(P=0.870)、Ruminococcustorquesgroup(P=0.599)、RuminococcaceaeUCG013(P=0.473)分析结果均不存在多效性。再次使用MR-PRESSO分析后上述所有菌群检测出的P值均≥0.05,无异常值。采用Cochran's检验异质性，该分析结果显示所有菌群的IVW和MR Egger的Q_pval均>0.05,均未出现异质性(表2)。

留一法方法表明，依次剔除GM的每个SNP后，剩余的SNPs对分析结果未产生显著影响，即没有单一的某个SNP对总体评估能够发挥有主导作用(图4)。

3、讨论

本研究通过双样本MR的分析方法分析了GM与POAG之间的发病关系。在该分析中，我们通过一系列质控措施对SNPs的筛选，如去除弱工具变量、去除混杂因素、MR分析、MR Egger回归、MR-PRESSO检验、Cochran'sQ检验，避免了混杂因素、水平多效性、异质性的影响，共鉴定出Butyrivibrio、Howardella、LachnospiraceaeUCG001、Candidatus Soleaferrea、RuminococcaceaeUCG013、Ruminococcustorquesgroup共6种人类GM与POAG的患病风险存在着因果关系。

GM失调或功能异常均会诱发局部或全身炎症，参与一系列疾病的发生发展，包括炎性肠病、自身免疫性疾病、癌症、代谢疾病以及神经退行性疾病等[13-15]。目前为止，GM失调在POAG中的发病机制仍不明确。Lachnospiraceae和Ruminococcaceae都是人类肠道微生物群的核心菌属，它们通过产生丁酸盐，从而了参与糖代谢过程[16]。另一项研究发现，丁酸盐治疗可抑制脱髓鞘并增强髓鞘再形成[17]。研究表明Lachnospiraceae和Ruminococcaceae丰富度的增加可能加速衰老[18]。在眼科疾病中，Lachnospiraceae和Ruminococcaceae与细菌性角膜炎和葡萄膜炎有关[19-20],Lachnospiraceae也与真菌性角膜炎和黏膜类天疱疮有关[21-22]。POAG患者和健康对照组之间约300个属的相对丰度存在显著差异，其中包括Lachnospiraceae和Ruminococcaceae。另一项孟德尔随机化研究，同样证实Ruminococcaceae是青光眼的危险因素[5]。这些研究和我们的结果表明，Lachnospiraceae和Ruminococcaceae也可能与青光眼的神经元炎症和免疫损伤有关。

图3 GM与POAG之间相关性的散点图

表2水平多效性检测和异质性检验结果

图4 GM与POAG相关性的留一法敏感性分析

POAG是以RGC丢失、视网膜神经纤维层(retinal nerve fibers layer, RNFL)变薄和视盘盘沿缺损为主要特征，而导致的眼部神经退行性疾病[23]。视神经是中枢神经系统的延长部分，且POAG跟脊髓性肌肉萎缩症(spinal muscular atrophy, SMA)、帕金森病(Parkinson disease, PD)、阿尔茨海默病(Alzheimer disease, AD)在许多的临床表现上有相似之处，包括年龄、症状前阶段、临床进展、遗传倾向和发病机制等[24]。Howardella的丰度与SMA密切相关[25],同时Howardella通过肌醇、2-硬脂酰甘油磷酸胆碱和α-谷氨酰酪氨酸代谢途径影响到重症新型冠状病毒肺炎[26]。Lachnospiraceae是AD认知障碍形成和PD发病的关键肠道细菌[27-28]。Lachnospiraceae能够产生短链脂肪酸(SCFA),例如丁酸盐。SCFA失调可能会影响“肠-脑轴”,从而导致神经炎症的发生和促使PD进展[29]。GM可能通过影响嘌呤代谢和调节氧化应激的关键代谢产物来改善认知障碍和延缓大脑衰老[30]。但是该结论仍需要进一步的研究验证。Lachnospiraceae还能够参与抑郁症的关键神经递质如谷氨酸、丁酸、5-羟色胺和γ-氨基丁酸的合成[31]。

研究报道[32]Butyrivibrio丰度的增加降低类风湿性关节炎发生的风险，且其与之间存在一定的因果关系。此外，Butyrivibrio作为一种常见的革兰氏阴性菌，血清学检测中POAG患者显示Butyrivibrio增加。革兰氏阴性菌可引起强烈的免疫反应，并通过其主要产物脂多糖(LPS)促进促炎细胞因子，一氧化氮和类花生酸的分泌[33]。Zhou等[34]研究表明Candidatus Soleaferrea与氧化应激引起炎症反应密切相关，而线粒体介导的氧化应激是POAG患者RGC损伤和人眼小梁网细胞死亡的关键。而目前为止，尚无明确的报道Ruminococcustorquesgroup与POAG疾病的发生发展有关，未来可进一步探究Ruminococcustorquesgroup引起POAG的发病机制。

尽管本文为POAG发病风险的研究提供了潜在的价值，但是本研究也同样存在一些局限性：(1)本研究基于GWAS的数据库汇总数据，缺乏对年龄、性别和治疗方式等变量的亚组分析。(2)本研究主要基于欧洲人群的GWAS数据，该项研究结果能否适用于其他种群的人群仍存在一定的限制，需要进一步验证[35]。(3)本研究仅局限于属这一层面上进行分析，未进一步在种层面上或具体菌群上予以分析。(4)本研究由足够的IVs进行MR分析，选取IVs时非传统全基因组显著水平，即P<5×10-8,而是使用P<1×10-5作为标准[4]。(5)该研究在GM对POAG的影响方面只是一个初步的研究，未来还需要扩大样本量以明确GM与POAG的因果关系，为POAG相关的“微生物-肠-眼轴”的研究寻找潜在的机制。

综上所述，本研究采用了双样本MR的分析方法探究GM与POAG之间的潜在因果关系。由于POAG具有致盲性，早期发病隐匿，发现时往往出现视野缺损，已进入病程发展中晚期，所以对于POAG的保护因素和危险因素的认识和及早干预具有重要意义。我们的研究结果可能为POAG存在的发病机制和治疗方法提供新思路。

参考文献:

[1]吴艳,杨璐.原发性开角型青光眼诊断的研究现状.国际眼科杂志,2021,21(9):1552-1556.

[7]姜佳译,陆培荣.肠道菌群在眼病中的作用研究进展.国际眼科杂志,2023,23(7):1153-1157.

文章来源:姚文,曹原,冯雁雯,等.肠道菌群与POAG因果关系的两样本孟德尔随机化研究[J].国际眼科杂志,2024,24(08):1291-1296.