慢性前列腺炎是一种泌尿生殖系统炎症综合征，主要表现为排尿异常和慢性盆腔疼痛，或伴有性功能障碍和精神神经症状。慢性非细菌性前列腺炎(chronic abacterial prostatitis, CNP)是最常见的类型，约占临床前列腺炎病例的90%[1]。由于CNP的病程长，易反复发作，且传统治疗(如抗生素、α-受体阻滞药)缺乏有效的临床疗效[2]。吡非尼酮(pirfenidone, PFD)是一种在多种动物实验和临床试验中表现出抗炎、抗纤维化和抗氧化应激能力的小分子化合物[3]。研究发现，PFD对慢性前列腺炎大鼠具有显著疗效[4]。本研究通过构建CNP大鼠模型，探究PFD对CNP的治疗作用及其潜在作用机制。

1、材料与方法

1材料

动物健康Wistar雄性大鼠，鼠龄7～8周，体质量200～225 g,购自长沙市天勤生物技术有限公司。动物生产许可证号：SCXK(湘)2019-0013。本实验经郴州市第一人民医院动物伦理委员会批准(伦理批号：20230718)。

细胞Raw264.7细胞，购自美国ATCC公司。

药品与试剂吡非尼酮胶囊，规格：每粒100 mg,批号：20240201,批准文号：国药准字H20133376,北京康蒂尼药业股份有限公司生产；塞来昔布胶囊，规格：每粒0.1 g,批号：20240117,批准文号：国药准字H20203356,四川国为制药有限公司生产；compound C[腺苷酸活化蛋白激酶(adenosine monophosphate activated protein kinase, AMPK)抑制药],规格：每瓶10 mg,纯度：>98%,批号：20240127,武汉科斯坦生物科技有限公司生产；角叉菜胶，规格：每瓶25 g,批号：20231210,上海西格玛奥德里奇贸易有限公司生产；脂多糖(lipopolysaccharide, LPS),规格：每瓶10 mg,纯度：>98%,批号：20240215,PFD,规格：每瓶250 mg,纯度：98%,批号：20231225,均为北京索莱宝科技有限公司生产。磷酸化-AMPK(phosphorylated AMPK,p-AMPK)、AMPK、磷酸化-核因子κB(phosphorylation-nuclear factor kappa B,p-NF-κB)、NF-κB、核因子κB抑制因子α(NF-κB inhibitorα,IκBα)、诱导型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase, iNOS)一抗、荧光标记的山羊抗兔免疫球蛋白G(immunoglobulin G,IgG) H&L二抗，均为英国Abcam公司生产；白细胞介素-6(interleukin-6,IL-6)、IL-1β、iNOS酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)试剂盒，均为上海康朗生物科技有限公司生产；肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factorα,TNF-α)ELISA试剂盒，上海化邦生物科技公司生产。引物，均由上海碧云天生物公司合成。

仪器Von Frey纤维丝测痛仪，上海玉研科学仪器有限公司产品；AMR-100T全自动酶标仪，杭州奥盛仪器有限公司产品；PikoReal五通道实时荧光定量聚合酶链反应(real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction, RT-qPCR)仪，美国赛默飞世尔科技有限公司产品。

2实验方法

2.1动物实验

2.1.1模型构建[5-6]

大鼠适应性饲养1周后，将大鼠麻醉后固定，腹部消毒后在腹部正中切口，暴露前列腺，在双侧精液囊中注射1%角叉菜胶溶液(每侧各50μL),然后进行缝合。

2.1.2动物分组与给药方法

将大鼠随机分为假手术组、模型组、阳性组、低剂量组、高剂量组、compound C组，每组10只；假手术大鼠按照“2.1.1”中方法暴露前列腺后注射等量的0.9%NaCl;其余组均按照“2.1.1”中方法建模；阳性组大鼠建模后21 d灌胃给予35 mg·kg-1塞来昔布悬浊液[7];低、高剂量组大鼠分别在建模21 d后分别灌胃给予50和150 mg·kg-1PFD;抑制药组大鼠建模后21 d灌胃给予150 mg·kg-1PFD和0.2 mg·kg-1compound C,连续给药14 d。

2.1.3 Von Frey纤维丝测痛仪测定各组大鼠机械疼痛阈值[7]

在末次药物处理后，将大鼠置于饲养笼内，在安静环境下适应30 min,然后用Von Frey纤维丝刺激前列腺附近的盆腔区域，连续刺激10次，每次10 s(每2次间隔超过30 s),刺激程度从0.1～60.0 g逐渐加重，当大鼠出现后腿跳跃、腹部剧烈收缩抵抗等行为时记录此时的疼痛压力值(机械疼痛阈值)。

2.1.4前列腺指数的测定[7]

末次给药后称量并记录各组大鼠体质量(g),检测完疼痛阈值后处死大鼠收集前列腺组织，清洗干净并擦干后称取前列腺质量(mg),计算前列腺指数(前列腺质量/体质量)。

2.1.5蛋白质印迹法检测组织相关蛋白的表达水平

各组前列腺组织称质量后，取部分组织，加入裂解液提取总蛋白，参考文献[8]的方法进行实验操作后，加入电化学发光试剂成像，并分析目的蛋白的灰度值。

2.1.6 ELISA法检测炎性因子的表达水平[9]

取部分大鼠前列腺组织，加入0.9%NaCl制成匀浆(组织-0.9%NaCl体积比为1∶9),离心收集上清液，然后根据试剂盒操作步骤检测IL-6、IL-1β、TNF-α和iNOS水平。

2.1.7 Tunel染色法检测细胞的凋亡情况

取各组前列腺组织，用4%多聚甲醛固定过夜后，用乙醇梯度脱水，用二甲苯透明2 h,浸蜡包埋后切片，按照参考文献[9]及说明书的方法，用Tunel染色法检测细胞凋亡情况，结束后用荧光显微镜观察。

2.2细胞实验

2.2.1细胞培养、细胞分组与处置方法[10]

Raw264.7细胞培养在DMEM培养基(含有10%胎牛血清)中，置于培养箱(37℃,5% CO2)中常规培养，细胞融合至70%～90%时对细胞进行传代。

收集对数期生长的细胞并随机分为对照组、LPS组、PFD组和联合组。对照组细胞正常培养；LPS组细胞用1μg·mL-1LPS处理细胞12 h; PFD组细胞先用4 mmoL·L-1PFD处理细胞2 h后再用1μg·mL-1LPS继续共处理至12 h;联合组细胞先用4 mmoL·L-1PFD和10μmoL·L-1compound C处理细胞2 h后再用1μg·mL-1LPS继续共处理至12 h。

2.2.2免疫荧光检测各组细胞iNOS的表达情况[11]

取处理后的各组细胞，多聚甲醛固定(15 min),磷酸盐缓冲液(phosphate buffer saline, PBS)清洗3次，Triton X-100室温下通透20 min,清洗后用5%牛血清蛋白室温下封闭60 min, PBS清洗后，滴加iNOS一抗(1∶500),4℃孵育过夜后滴加荧光二抗(1∶200),室温孵育60 min,然后滴加4′,6-二脒基-2-苯基吲哚试剂进行核染(暗处孵育5 min),结束后用含抗荧光淬灭剂的封片液封片，在荧光显微镜下观察。

2.2.3 ELISA法检测各组细胞炎性因子表达[9]

将细胞接种在24孔板中每孔接种1×105个细胞，分组处理后离心收集上清液，按“2.1.6”的方法检测IL-6、IL-1β和TNF-α水平。

3统计学处理

用SPSS 25.0软件进行统计分析。计量资料用表示，2组间比较用独立样本t检验，多组间比较用单因素方差分析。

2、结 果

1 PFD对CNP大鼠盆腔机械痛阈值及前列腺指数的影响

假手术组注射等量的0.9%NaCl,模型组注射1%角叉菜胶，阳性组灌胃给予35 mg·kg-1塞来昔布，低、高剂量组分别灌胃给予50和150 mg·kg-1PFD,compound C组灌胃给予150 mg·kg-1PFD和0.2 mg·kg-1compound C。

假手术组、模型组、阳性组、低剂量组、高剂量组和抑制药组的机械疼痛阈值分别为(45.33±5.09)、(23.13±3.20)、(35.27±4.65)、(27.61±2.44)、(33.96±2.65)和(30.30±4.77)g,前列腺指数分别为(1.36±0.12)、(0.83±0.08)、(1.24±0.20)、(0.93±0.05)、(1.11±0.10)和(0.98±0.10)mg·g-1;模型组与假手术组比较，大鼠疼痛阈值与前列腺指数均显著降低(均P<0.05);低、高剂量组及阳性的疼痛阈值与前列腺指数均较模型组显著升高(均P<0.05);compound C组与高剂量组比较，疼痛阈值与前列腺指数均显著降低(均P<0.05)。

2 PFD对CNP大鼠前列腺组织通路相关蛋白表达的影响

模型组与假手术组比较，p-AMPK、IκBα蛋白相对表达水平均显著降低，p-NF-κB蛋白相对表达水平显著升高(均P<0.05);低、高剂量组与模型组比较，p-AMPK、IκBα蛋白相对表达水平均显著升高，p-NF-κB蛋白相对表达水平均显著降低(均P<0.05);compound C组与高剂量组比较，p-AMPK、IκBα蛋白相对表达水平均显著降低，p-NF-κB蛋白相对表达水平显著升高(均P<0.05),见表1。

3 PFD对CNP大鼠前列腺组织炎性细胞因子及凋亡的影响

模型组与假手术组比较，IL-6、TNF-α、IL-1β、iNOS水平及细胞凋亡率均显著升高(均P<0.05);低、高剂量组和阳性组的IL-6、TNF-α、IL-1β、iNOS水平及细胞凋亡率均较模型组显著降低(均P<0.05);compound C组与高剂量组比较，IL-6、TNF-α、IL-1β、iNOS水平及细胞凋亡率均显著升高(均P<0.05),见表2。

4 PFD抑制巨噬细胞M1极化

对照组给予正常培养；LPS组给予1μg·mL-1的LPS;PFD组给予4 mmoL·L-1的PFD+1μg·mL-1的LPS;联合组给予4 mmoL·L-1的PFD+10μmoL·L-1的compound C+1μg·mL-1的LPS。

对照组、LPS组、PFD组、联合组的iNOS光密度值分别为1 174.85±65.20、4 508.84±271.50、2 069.75±211.15和3 725.81±292.42;LPS组的iNOS光密度值较对照组显著升高，PFD组的iNOS光密度值较LPS组显著降低，联合组的iNOS光密度值较PFD组显著升高(均P<0.05)。结果见图1。

表1各组大鼠腺苷酸活化蛋白激酶/核因子κB(AMPK/NF-κB)通路相关蛋白表达水平的比较

表2各组大鼠炎性因子及凋亡率的比较

图1用免疫荧光检测各组细胞诱导型一氧化氮合酶(iNOS)的表达情况(显微镜，×200)

5 PFD体外抑制巨噬细胞分泌炎性因子

LPS组与对照组比较，细胞中IL-6、TNF-α、IL-1β表达水平均显著升高(均P<0.05);PFD组与LPS组比较，细胞中IL-6、TNF-α、IL-1β表达水平均显著降低(均P<0.05);联合组与PFD组比较，细胞中IL-6、TNF-α、IL-1β表达水平均显著升高(均P<0.05),见表3。

表3各组细胞炎性因子表达的比较

3、讨 论

PFD作为一种吡啶类的小分子物质，其具有显著的抗炎[12]、抗纤维化[13]等功效。临床研究表明，PFD可以显著降低间质性肺炎合并关节炎患者体内炎性指标[14]。动物实验也表明，PFD在改善前列腺炎盆腔疼痛和抑制炎性介质分泌中具有积极作用[4],这些证据均提示PFD在治疗CNP中具有较大潜力。本实验中观察到PFD可显著提高CNP大鼠疼痛阈值及前列腺指数，这与PENG等[4]研究结果一致，提示PFD在改善CNP盆腔疼痛上具有显著作用。

AMPK是一种关键的能量传感器，对维持细胞能量稳态十分重要。AMPK在能量缺乏时被激活，导致能量利用途径被抑制，能量产生途径被刺激，这主要通过腺苷单磷酸或腺苷二磷酸与AMPK的调节性γ亚基直接结合介导，导致构象变化，并因此导致AMPK催化性α亚基在Thr172位点发生磷酸化。虽然α亚基在Thr172位点的磷酸化被认为是AMPK的主要激活性翻译后修饰，但α和β亚基上还存在多个其他磷酸化位点。研究证实，AMPKα亚基上Ser485/491的蛋白激酶A依赖性磷酸化会导致AMPK活性受到抑制[15-16]。AMPK的激活在许多疼痛模型中可以通过多种途径发挥镇痛作用[17]。多个研究已经指出，NF-κB通路是AMPK的下游信号，AMPK的激活可通过抑制NF-κB信号发挥抗炎作用[18-19]。本研究结果发现，经PFD治疗后，CNP大鼠前列腺组织中AMPK被激活，NF-κB p65表达受到抑制，且NF-κB信号下游因子IκBα的表达明显提高，这提示PFD缓解CNP大鼠症状可能通过调节AMPK/NF-κB信号实现。此外，本研究结果还发现，PFD对CNP大鼠前列腺组织促炎介质IL-6、TNF-α、IL-1β、iNOS及Bax表达、细胞凋亡的抑制作用，及对Bcl-2的诱导作用均可被AMPK抑制药compound C削弱；这提示PFD可以通过激活AMPK抑制NF-κB炎症信号，从而对CNP大鼠发挥其抗炎作用。

巨噬细胞是先天免疫的重要组成部分，在炎症和宿主防御中发挥着核心作用，此外，这些细胞还发挥防御以外的稳态功能，包括个体发育中的组织重塑和代谢功能的协调[20-21]。单核细胞-巨噬细胞谱系的特点是具有相当大的多样性和可塑性，在组织中，单核巨噬细胞对环境因素(例如微生物产物、受损细胞、活化淋巴细胞)作出反应，获得不同的功能表型，在各种信号的作用下，巨噬细胞可能会经历经典的M1活化(受Toll样受体配体和干扰素-γ刺激)或替代的M2活化(受IL-4/IL-13刺激)[22-23]。巨噬细胞在机体炎性进展中发挥重要角色。华晓亮[10]研究表明，抑制巨噬细胞向M1型极化对抑制CNP发展至关重要。有证据表明，PFD在抑制巨噬细胞分泌炎性介质上具有显著作用[24],且已有研究报道，PFD可通过促进巨噬细胞向M2型极化在CNP中发挥抗炎作用[4]。iNOS是M1型巨噬细胞标志蛋白，本研究通过LPS体外诱导巨噬细胞促进巨噬细胞向M1型极化，细胞免疫荧光实验发现，经PFD处理后，iNOS荧光强度明显减弱，同时PFD还显著抑制由M1巨噬细胞分泌的炎性介质(IL-6、TNF-α、IL-1β)的表达，这与体内实验结果一致，提示PFD可通过抑制巨噬细胞向M1型极化，进而抑制由M1型巨噬细胞分泌的炎性介质的表达，对CNP发挥抗炎作用。进一步用AMPK抑制药compound C处理细胞发现，PFD对巨噬细胞向M1型极化的抑制作用被部分逆转，提示PFD可能通过调控AMPK/NF-κB信号抑制巨噬细胞向M1型极化，不过这仍需要大量的实验进一步进行验证。

本研究提示：PFD可能通过AMPK/NF-κB信号抑制巨噬细胞向M1型极化，减轻炎症反应和凋亡，改善CNP盆腔疼痛。

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文章来源:杜宇峰,王颖新,陈煌辉,等.吡非尼酮对慢性非细菌性前列腺炎大鼠的作用[J].中国临床药理学杂志,2024,40(19):2858-2863.