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LncRNA UCA-1对肾细胞癌OS-RC-2细胞增殖、凋亡的影响及机制

2024-11-30 74 上传者：管理员

摘要：目的研究尿路上皮癌相关基因1(UCA-1)对肾细胞癌OS-RC-2细胞恶性生物学进程的影响。方法通过实时荧光定量PCR方法分析肾细胞癌组织与癌旁组织中UCA-1的表达；将肾细胞癌OS-RC-2细胞随机设置为3个实验组：siRNA NC组、siRNA UCA-1组与LY294002组。采用MTT实验方法分析OS-RC-2细胞的增殖速度；采用Transwell实验方法分析OS-RC-2细胞的侵袭数量；采用流式细胞术检测OS-RC-2细胞的凋亡情况；采用蛋白免疫印迹方法分析PI3K/AKT通路相关蛋白的表达。结果与肾细胞癌旁的组织比较，肾细胞癌组织的UCA-1表达上调。与siRNA NC组比较，siRNA UCA-1组以及LY294002组的OS-RC-2细胞增殖能力下降(P<0.05);OS-RC-2细胞侵袭数量下降(P<0.05);OS-RC-2细胞凋亡率增加(P<0.05);OS-RC-2细胞PI3K、AKT蛋白表达下调(P<0.05)。结论 UCA-1在肾细胞癌细胞中表达增加，抑制UCA-1表达后，OS-RC-2细胞的增殖速度与侵袭数量降低，凋亡率增加，该机制与UCA-1调节PI3K/AKT信号通路相关。

关键词：
AKT
PI3K
siRNA
凋亡
增殖
尿路上皮癌相关基因1
肾细胞癌
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肾细胞癌(renal cell carcinoma, RCC)是人类泌尿生殖系统最常见的癌症类型，它的死亡率为30%～40%,男性比女性更常见[1]。除性别外，其他肾癌的危险因素包括肥胖、高血压、吸烟和慢性肾脏疾病。基于组织学和分子亚型，最常见的肾细胞癌类型是透明细胞癌，由于相关抑癌基因突变而经常发生[2-3]。目前，根治性肾切除术和部分肾切除术常用于切除肾组织中的小肿瘤。然而，这些方法对肾细胞癌患者预后仍不理想[4]。因此，寻找新的靶点对于肾细胞癌的治疗具有重要意义。

长链非编码RNA(Long non-coding RNA,LncRNA)尿路上皮癌相关基因1(urothelial carcinoma antigen 1,UCA-1)首次在膀胱癌中被发现，其异常激活与多种肿瘤进展相关[5-6]。近期研究[7-9]表明，UCA-1能够通过激活磷脂酰肌醇3激酶/丝氨酸-苏氨酸激酶(phosphatidylinositol 3-kinase/serine-threonine kinase, PI3K/AKT)通路促进肾上皮细胞葡萄糖摄取能力。然而，关于UCA-1与肾细胞癌细胞增殖、凋亡的关系尚不清晰。因此，本研究通过分析UCA-1对肾细胞癌细胞增殖、凋亡的影响，以期为肾细胞癌的治疗提供新思路。

1、材料与方法

1.1实验细胞与临床样本

人肾细胞癌细胞系OS-RC-2细胞购自上海匹拓生物科技有限公司。从2022年9月至2023年11月间在本院诊治的17例肾细胞癌患者手术过程中获取癌组织与癌旁组织，并将样本组织置于液氮保存。

1.2试剂

磷酸盐缓冲液(武汉益普生物科技有限公司);RIPA裂解液(广州博鹭腾生物科技有限公司);脱脂奶粉(北京康瑞纳生物科技有限公司);RPMI-1640培养基(广东环凯生物科技有限公司);MTT试剂(无锡耐思生命科技股份有限公司);无水乙醇(上海远慕生物科技有限公司);siRNA NC、siRNA UCA-1(纯度98.97%,上海吉玛基因公司);PI3K/AKT通路抑制剂LY294002(纯度99.86%,北京擎科生物科技股份有限公司);胎牛血清(上海淳麦生物科技有限公司);脂质体2000(上海吉至生化科技有限公司);PI3K、AKT以及GAPDH单克隆抗体(上海佰利莱生物科技有限公司)。

1.3仪器

Olympus CKX41型光学显微镜(日本Olympus公司);SpectraMax iD5多功能微孔板读板机(美国Molecular Devices公司);S41i摇床(美国Eppendorf公司);MCO-5M细胞培养箱(日本松下公司);Bio-Rad Basic伯乐电泳仪(美国Bio-Rad公司)。

1.4方法

1.4.1实时荧光定量PCR检测LncRNA UCA-1的表达

按照制造商的说明，使用TRIzol试剂从实验样本中提取总RNA含量，使用NanoDrop分光光度计测定RNA浓度。随后，利用逆转录试剂对互补DNA进行逆转录。使用Power SYBR green PCR master Mix进行基因表达分析，mRNA表达水平以GAPDH为标准。本研究所用引物序列见表1。

表1引物序列信息

1.4.2细胞培养

将OS-RC-2细胞培养在含9%浓度胎牛血清的培养基中，待培养至贴壁时，将细胞随机分为3组：siRNA NC组、siRNA UCA-1组以及PI3K/AKT通路抑制剂(LY294002)组。并参照说明书步骤用脂质体2000转染各组siRNA(0.1μmol/L)以及LY294002(10μmol/L)至对应实验组，转染36h后，更换完全培养基。

1.4.3 MTT实验检测OS-RC-2细胞增殖

将数量相同的OS-RC-2细胞培养于96孔板，每个实验组设置6个平行对照，培养72h,在此后12、24、36h,每孔均用80μL MTT试剂在培养箱处理2h,在酶标仪中在570nm处进行吸光度检测。

1.4.4 Transwell实验统计OS-RC-2细胞侵袭数量

将OS-RC-2细胞种植在不含胎牛血清的上室培养液中，并将含10%胎牛血清的培养基添加到下室。每个实验组设置6个平行对照，将Transwell置于培养箱24h。随后去掉非侵袭的OS-RC-2细胞，显微镜下观察侵袭细胞数量。

1.4.5流式细胞术检测OS-RC-2细胞凋亡率

采用细胞凋亡检测试剂盒分析OS-RC-2细胞凋亡率。将1×106个OS-RC-2细胞转移至500μL缓冲液中，每个实验组设置6个平行对照，加入10μL FITC Annexin V和10μL碘化丙啶，避光情况下孵育30min。随后磷酸缓冲液漂洗OS-RC-2细胞，通过流式细胞仪分析细胞凋亡率。

1.4.6 OS-RC-2细胞中PI3K/AKT通路相关蛋白水平检测

使用含细胞蛋白酶抑制剂的RIPA裂解缓冲液提取OS-RC-2细胞总蛋白，所有蛋白在12%聚丙烯酰胺凝胶上分离，随后将PI3K、AKT和GAPDH蛋白转移到蛋白吸附膜并与封闭缓冲液孵育。将膜与一级抗体孵育。随后，将膜与二级抗体孵育。采用ECL化学发光法进行可视化，GAPDH为内参蛋白，每个实验组设置6个平行对照。

1.5统计学方法

所有数据以均数±标准差表示，采用GraphPad Prism 9软件进行统计分析。两组间比较采用t检验，多组间比较采用单因素方差分析。P<0.05为差异有统计学意义。所有结果均代表6个独立实验产生的数据。

2、结果

2.1 UCA-1在肾细胞癌组织中的表达

实时荧光定量PCR实验结果显示，与癌旁组织比较，肾细胞癌组织的UCA-1表达水平上升(0.13±0.02 vs 0.92±0.11,P<0.05)。见图1。

图1 UCA-1在肾细胞癌组织中的表达

与癌旁组织相比，*P<0.05,n=6。

2.2 UCA-1在不同转染OS-RC-2细胞中的表达

实时荧光定量PCR实验结果显示，与siRNA NC组比较，siRNA UCA-1组OS-RC-2细胞的UCA-1表达降低(0.83±0.05 vs 0.11±0.02,P<0.05),见图2。

图2 UCA-1在不同转染OS-RC-2细胞中的表达

与siRNA NC组比较，*P<0.05,n=6。

2.3 UCA-1对OS-RC-2细胞增殖的影响

MTT实验检测发现，培养24、36h时，与siRNA NC组比较，siRNA UCA-1组与LY294002组的OS-RC-2细胞生长速度减缓(1.23±0.08 vs 0.78±0.03 vs 0.71±0.06,P<0.05;2.59±0.08 vs 1.56±0.15 vs 1.39±0.09,P<0.05)。见图3。

图3 UCA-1对OS-RC-2细胞增殖的影响

2.4 UCA-1对OS-RC-2细胞侵袭的影响

Transwell实验结果显示，与siRNA NC组比较，siRNA UCA-1组与LY294002组的OS-RC-2细胞侵袭数减少(85.23±9.22 vs 36.62±7.75 vs 39.83±11.58,P<0.05)。见图4与图5。

图4 UCA-1对OS-RC-2细胞侵袭的影响(标尺：50μm)

图5 UCA-1对OS-RC-2细胞侵袭的影响

2.5 UCA-1对OS-RC-2细胞凋亡的影响

流式细胞仪分析发现，与siRNA NC组比较，siRNA UCA-1组与LY294002组OS-RC-2细胞凋亡率上升(14.56±0.25 vs 23.13±2.15 vs 23.25±1.87,P<0.05)。见图6与图7。

图6 UCA-1对OS-RC-2细胞凋亡的影响

图7 UCA-1对OS-RC-2细胞凋亡的影响

2.6下调UCA-1对PI3K/AKT通路的影响

与siRNA NC组比较，siRNA UCA-1组与LY294002组OS-RC-2细胞的PI3K、AKT蛋白表达水平降低(0.68±0.25 vs 0.25±0.11 vs 0.29±0.06,P<0.05;0.71±0.08 vs 0.19±0.03 vs 0.21±0.06,P<0.05)。见图8与图9。

图8 UCA-1对PI3K/AKT通路的影响

图9 UCA-1对PI3K/AKT通路的影响

3、讨论

肾细胞癌是一种具有多种遗传和表观遗传改变的癌症类型。有学者于1997年首次提出了基于分子遗传学的肾癌分类，该分类随后进入世界卫生组织肿瘤分类，温哥华国际肿瘤学协会肿瘤目录[2]。约3%的肾细胞癌病例有常染色体显性遗传的家族背景。因此，肾细胞癌可分为散发型和遗传型。不同亚型的肾癌在导致肾癌的基因中存在不同的突变和表观遗传学改变[4]。异常的PI3K/AKT信号通路与肿瘤增殖、迁移、侵袭和耐药相关[10]。肾细胞癌常伴随PI3K/AKT基因表达上调，近期研究发现，尽管PI3K/AKT通路没有突变，PI3K/AKT通路在所有肾细胞癌亚型的致癌过程中都发挥着作用，PI3K/AKT通路已被证明是肾细胞癌的治疗分子靶点[11-12]。鉴于PI3K/AKT通路在肿瘤发生中的作用，本研究通过抑制肾细胞癌OS-RC-2细胞中PI3K/AKT通路后发现，OS-RC-2细胞的增殖以及侵袭能力降低，细胞凋亡率增加。因此，PI3K/AKT通路的激活对肾细胞癌的转移具有促进作用。

据报道，UCA-1首次在膀胱癌中被发现，其异常激活与多种肿瘤恶性进展相关。例如，UCA-1上调后能够促进非小细胞肺癌和乳腺癌细胞的增殖和迁移，并减少癌细胞凋亡[13]。此外，在皮下移植瘤小鼠模型中，上调UCA-1后，小鼠皮下移植瘤体积增加速度加快，而抑制UCA-1表达后，小鼠皮下移植瘤体积增加速度减缓[14]。近期研究表明，UCA-1能够通过激活PI3K/AKT通路促进肾上皮细胞葡萄糖摄取能力[15]。然而，关于UCA-1与肾细胞癌细胞增殖、凋亡的关系尚不清晰。为进一步UCA-1对肾细胞癌细胞恶性生物学进程的影响，在本研究中，我们比较肾细胞癌组织与癌旁的组织发现，UCA-1蛋白在肾细胞癌组织中高表达。此外，体外实验分析表明，在肾细胞癌OS-RC-2细胞中，下调UCA-1水平后，肾细胞癌OS-RC-2细胞的增殖，侵袭能力受到抑制，并且OS-RC-2细胞凋亡率增加。此外，抑制UCA-1表达后，PI3K/AKT信号通路相关蛋白表达水平降低。这些研究表明，UCA-1能够调控PI3K/AKT信号通路，是一个有前景的治疗肾细胞癌新靶点。

本研究结果显示，UCA-1在肾细胞癌组织中表达上调。抑制UCA-1表达后，OS-RC-2细胞的增殖与侵袭能力下降，凋亡率上升，同时UCA-1的这一作用与调控PI3K/ AKT信号通路相关。

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