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CCN1对食管癌细胞APRIL/BAFF表达的影响

2024-12-26 35 上传者：管理员

摘要：目的:探究CCN1蛋白在食管癌中对增殖诱导配体(APRIL)和B细胞刺激因子(BAFF)所起到的作用。方法:用质粒转染技术在细胞株KYSE150及OE-19中过表达CCN1,Western blot验证其转染效果，同时检测APRIL和BAFF的表达情况。结果:在KYSE150细胞中过表达CCN1后，APRIL/BAFF高表达(P<0.05);在OE19细胞中过表达CCN1后，APRIL/BAFF低表达(P<0.05)。结论:CCN1在食管鳞癌细胞KYSE150中对APRIL/BAFF为激活作用，在食管腺癌细胞OE19中对APRIL/BAFF为抑制作用。

关键词：
CCN1
SCC
增殖诱导配体
细胞刺激因子
食管癌
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到60. 41 万例,其中导致患者死亡的病例数为 54. 41 万例｡对应的年龄标准化发病率和死亡率分别为 6. 3 /10 万和 5. 6 /10 万｡大多数病例( 85% , 512 500 例) 为食管鳞状细胞癌( squamous cell carcinoma,SCC) ,14% ( 85 700 例) 为食管腺癌( adenocarcinoma,AC) ｡需要注意的是,男性的发病率和死亡率比女性高出 2 至 3 倍｡即使按照目前的食管癌发病率估算,预计到 2040 年将有 95. 7 万例新发食管癌病例( 其中 14. 13 万例为食管腺癌,80. 6 万例为食管鳞状细胞癌) 以及 88 万例食管癌相关死亡病例 [1]｡这些最新估计数据对于制定防控政策和减少当前及将来降低食管癌发病率有重要意义｡但现阶段食管癌的一､二级预防仍然是关键,尤其筛查和早期发现并管理食管癌高危人群是防患食管癌的主要措施,因而研究和发现食管癌发生或发展分子靶点显得尤为重要｡

富半胱氨酸61 ( Cellular communication network factor 1,CCN1) 是一种支持细胞黏附､迁移和存活的基质蛋白,它对癌细胞的作用取决于癌细胞的种类｡研究发现,CCN1 在乳腺癌和胰腺癌中支持肿瘤生长, 而在子宫内膜癌､非小细胞肺癌和食管腺癌中,CCN1 诱导肿瘤细胞凋亡[2]｡肿瘤的发病与炎症反应有密切关系,期间有大量炎症反应因子的释放,特别是肿瘤坏死因子( tumor necrosis factor,TNF) 家族的成员｡它们中的许多既能促进细胞生长,又能诱导细胞死亡[3]｡B 细胞活化因子 ( cell - activating factor, BAFF) 和增殖诱导配体( a proliferation inducing ligand,APRIL) 属于 TNF 家族｡BAFF 最初是作为一种 B 细胞存活因子被发现的,而 APRIL 最初是作为一种在各种癌症中高表达的蛋白质被发现的[4]｡在不同的癌症中检测到高水平的 BAFF､APRIL 及其受体,并发现它们与疾病严重程度和治疗反应有关[5]｡本研究旨在探讨 APRIL 和 BAFF 在食管癌中扮演的角色, 以及 CCN1 对二者的调控作用｡

1、材料与方法

1. 1 材料

人食管腺癌细胞OE - 19( OE - 19 人食管癌细胞系是于 1993 年从一名 72 岁男性患者的贲门和食管胃交界处的腺癌中建立) ,由首都医科大学中心实验室提供｡人食管鳞癌细胞 KYSE150( KYSE -150 细胞来源于一名 49 岁妇女接受放疗后从颈部食管切除的低分化食管鳞状细胞癌) ,购买于上海盈湾生物科技公司｡CCN1( CYR61) 质粒及空载质粒 ( 湖南优宝生物公司) ; CCN1 抗体( 美国 ORIGENE 公司) ; β - actin 抗体( SANTA CRUZ 公司) ; APRIL 抗体､BAFF 抗体( R&D SYSTEMS 公司) ; 山羊抗兔抗体､山羊抗鼠抗体､兔抗山羊抗体( 中杉金桥公司购买) ; BCA 试剂盒( 从美国 THERMO FISHER 公司购买) ; iMarK 酶标仪､PowerPac Basic 电泳仪及 XRS + 凝胶成像仪( 美国 Bio - Rad 公司) ｡

1. 2 实验方法

1. 2. 1 细胞培养 OE - 19 和 KYSE150 细胞在含有 10% 的胎牛血清和 10% 双抗的 RPMI 1640 培养液中进行培养｡细胞培养分别在 75 mm2 和 25 mm2 的培养瓶中,培养条件为 37 ℃､5% CO2 的恒温培养箱｡( 1) 细胞复苏: 从 - 80 ℃ 冰箱中取出冻存细胞,在 37 ℃ 的水浴锅中融化,遵循“慢冻快溶”原则｡将融化的细胞使用移液枪转移至 1. 5 mL 离心管中,1 000 g 离心 30 s,弃掉上清液,加入 1 mL 培养液混匀细胞,然后将混合物转移到提前加有 10 mL全培养基的培养瓶中,吹打均匀｡最后,将培养瓶放入恒温培养箱中进行培养｡( 2) 细胞冻存: 弃去培养瓶中的培养基,PBS 清洗细胞,加入 1 mL 胰酶,放入培养箱,消化 5 min｡加入 1 mL 培养液终止消化,然后转移至离心管中,离心 1 min,弃掉上清,加入 1 mL 冻存液,混匀,吸进冻存管中,直接放入 - 80 ℃ 冰箱｡( 3 ) 细胞传代: 当细胞生长至 80% ~ 90% 时,进行传代操作｡弃掉培养液,PBS 清洗 2 次,加入1 mL胰酶,放入恒温培养箱中消化 5 min,加入 1 mL 培养液终止消化,然后转移到离心管中,离心1 min,弃掉上清,加入 1 mL 培养液,将混合物转移至提前加有 10 mL 全培养基的培养瓶中, 混匀｡最后,将培养瓶放入恒温培养箱中｡

1. 2. 2 细胞转染将 OE - 19 和 KYSE - 150 细胞接种到 6 孔板中,等待细胞密度达到 70% ~ 80% 时使用减血清培养基培养,将 CCN1 质粒和空载质粒转染进相应的孔中,加入转染试剂 Plus Reagent,静置 10 min,然后加入另一个转染试剂 Lipofectamine LTx Reagent,静置 30 min,将 6 孔板放入培养箱｡ 6 ~ 8 h后,更换为完全培养基,48 h 后,进行 WB 评估转染效果｡

1. 2. 3 蛋白免疫印迹等量的蛋白质样品在100 V 的微型凝胶中分离,并将其转移到 390 mA 的硝化纤维素膜上 90 min｡首先用 5% 脱脂牛奶阻断膜 1 h,然后在摇床上用一抗孵育 2 h( 一抗稀释浓度: 1 /2 000) ｡用 TBST 缓冲液洗涤 3 × 10 min 后,用酶标抗兔或抗小鼠二抗( 二抗稀释浓度: 1 /5 000) 在摇床上孵育 1 h｡条带的信号在 ECL 发光液的作用下形成,使用 Gel Doc XR ( Bio - Rad,Hercules,USA) 捕获和定量图像｡在相同的内参印迹实验条件下, 比较目标蛋白的表达｡这些数据来自至少 5 个独立的实验｡

1. 2. 4 统计学分析采用 GraphPad 8. 0. 2 软件进行统计学分析,数据符合正态分布,但方差未知,所以均采用 t 检验,以 P < 0. 05 为差异有统计学意义｡

2、结果

2. 1 在 KYSE150 细胞中过表达 CCN1 对 APRIL 表达的影响

为了过表达CCN1,使用 CCN1 质粒和其空载质粒转染进 KYSE150 细胞,免疫印迹实验证明已经成功转染,CCN1 在鳞癌细胞 KYSE150 中自然表达,WB 结果中表现为分子量 40 kDa 的内源性条带,转染进细胞 CCN1 外源性质粒表现为一条分子量 42 kDa 的条带｡在 KYSE150 细胞中过表达 CCN1,转染组 APRIL 的表达高于空载组,其差异有统计学意义( P < 0. 05) ,说明在鳞癌细胞 KYSE150 中 CCN1 对 APRIL 为激活作用｡见图 1｡

2. 2 在 OE - 19 细胞中过表达 CCN1 对 APRIL 表达的影响

为了过表达CCN1,使用 CCN1 质粒和其空载质粒转染进 OE19 细胞,免疫印迹实验证明已经成功转染｡食管腺癌中几乎不表达 CCN1,所以 WB 结果中只有一条 42 kDa 的外源性 CCN1 条带｡在 OE - 19 细胞中过表达 CCN1,转染组 APRIL 的表达低于空载组,其差异有统计学意义( P < 0. 05) ,说明在腺癌细胞 OE - 19 中 CCN1 对 APRIL 为抑制作用｡见图 2｡

图1 在 KYSE150 细胞中过表达 CCN1 对 APRIL 的作用

图2 在 OE - 19 细胞中过表达 CCN1 对 APRIL 的作用

2. 3 在 KYSE150 细胞中过表达 CCN1 对 BAFF表达的影响

为了过表达CCN1,使用 CCN1 质粒和其空载质粒转染进 KYSE150 细胞,免疫印迹实验证明已经成功转染｡在 KYSE150 细胞中过表达 CCN1, 转染组 BAFF 的表达高于空载组,其差异有统计学意义 ( P < 0. 05 ) ,说明在鳞癌细胞 KYSE150 中 CCN1 对 BAFF 为激活作用｡见图 3｡

2. 4 在 OE - 19 细胞中过表达CCN1 对 BAFF 表达的影响

为了过表达CCN1,使用 CCN1 质粒和其空载质粒转染进 OE19 细胞,免疫印迹实验证明已经成功转染｡在 OE - 19 细胞中过表达 CCN1,转染组 BAFF 的表达低于空载组,其差异有统计学意义｡说明在腺癌细胞 OE - 19 中 CCN1 对 BAFF 为抑制作用｡见图 4｡

图3 在 KYSE150 细胞中过表达 CCN1 对 BAFF 的作用

图4 在 OE - 19 细胞中过表达 CCN1 对 BAFF 的作用

3、讨论

TNF 家族成员 BAFF 和 APRIL 及其同源受体对 B 细胞的分化､存活和功能至关重要,因此对体液免疫的维持至关重要｡BAFF - APRIL 系统还可以直接或间接调节其他免疫和非免疫细胞的功能｡临床和实验证据表明,异常的 BAFF - APRIL 产生会破坏免疫稳态,破坏免疫耐受,并加剧癌细胞的增殖和侵袭｡BAFF - APRIL 系统是免疫系统的一个重要特征,对维持 B 细胞和体液免疫至关重要,该系统在慢性炎症性疾病的炎症反应中起重要作用,包括自身免疫[6]｡BAFF､APRIL 和它们各自受体的表达通常被认为是癌症进展和治疗反应的生物标志物｡ BAFF - APRIL 系统已经发展成为一个相互关联的复杂信号级联,调节细胞分化､存活､增殖和迁移｡因此,BAFF /APRIL 系统是微环境的关键病理调节剂,可能支持血液学和实体癌的肿瘤生长｡然而, BAFF - APRIL 系统在癌症的初始恶性转化和进展中的作用在很大程度上仍未被探索,特别是在实体和非 B 细胞血液学癌症中[7]｡BAFF - APRIL 系统已经被很好地用于开发各种针对血液病癌症的新疗法,特别是多发性骨髓瘤中｡尽管这些新产品尚未在临床中得到验证,并且其中一些与显著的毒性有关,但针对 BAFF - APRIL 系统的治疗方法的改进日益受到关注,这证明了该系统在癌症进展中的关键重要性｡开发治疗方法的主要挑战之一是有效地靶向 BAFF - APRIL 系统,同时保持保护性 B 细胞依赖性免疫并减少相关副作用[8]｡在本实验中,我们主要研究在 CCN1 调控下 BAFF - APRIL 系统在食管腺癌和食管鳞癌中的作用,更清楚地了解这个因素在癌症中的确切作用,将为识别用于早期诊断的新生物标志物和开发新的治疗策略铺平道路｡

CCN1 是一个细胞间质蛋白,正常情况下,以促进细胞增殖､细胞运动､细胞附着､细胞凋亡为主要功能｡而对于癌细胞来说,有些癌细胞能借助 CCN1 的这些特性繁衍增殖,转移侵蚀,但另外一些癌细胞则会被 CCN1 抑制｡食管癌便是一个很好的例子｡CCN1 有助于食管鳞癌的生长,但却能置食管腺癌于死地｡因此,与正常食管上皮细胞相比,食管鳞癌过表达 CCN1,而食管腺癌则几乎不表达 CCN1｡我们用 CCN1 质粒转染了细胞 KYSE150 和 OE19,检查了过表达 CCN1 对 APRIL /BAFF 的影响｡在鳞癌细胞中,CCN1 的表达的增加引起了 APRIL分泌的增加,导致了 APRIL 的表达上升｡ CCN1 对 BAFF 也是同样的作用,过表达 CCN1 增加了 BAFF 的分泌｡总而言之,在食管鳞癌中,CCN1 不仅提升了这两个分子的表达,而且还促进了它们的切割与排放; 而在食管腺癌中,CCN1 降低了 APRIL /BAFF 的切割和排放｡这意味着,在食管腺癌中,CCN1 并不支持 APRIL /BAFF 的作用｡因此, CCN1 抑制了食管腺癌细胞中 APRIL /BAFF 这个系统的作用,不利于细胞生长｡相反地,在食管鳞癌细胞中,CCN1 促进 APRIL /BAFF 的表达,由此促进鳞癌细胞的繁衍｡

本课题的局限和不足: 本研究未进行动物实验等用于体内实验层面共同证明上述结果与结论｡其次,实验方法单一,实验结果证明力度较薄弱,应该加大样本量,多种实验方法验证｡应继续挖掘本课题中还未引起关注的领域和突破点,为食管癌临床治疗以及消化内科相关疾病的治疗提供更多分子生物学研究数据及基础,为以后消化道肿瘤防治发现新的作用靶点｡

基金资助:内蒙古自然科学基金项目(2020LH08005);内蒙古自治区高等学校科学研究项目(JZY22057,NJZY22095);包头医学院青年科技人才发展计划(YTT-QNGG2022065); 内蒙古医学科学院临床需求性基础研究项目(2023GLLH0213);内蒙古自治区教育科学研究“十四五”规划课题(NGJGH2023539);

文章来源:邢玲玲,刘琳,江振宇,等.CCN1对食管癌细胞APRIL/BAFF表达的影响[J].包头医学院学报,2024,40(12):13-17.