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摘要:目的 探索基于去活化CasMINI蛋白(dCasMINI)的CRISPR干扰(CRISPRi)工具设计及其转录抑制效果评估。方法 采用四环素诱导基因开启系统(tet-on),流式细胞测量术和实时荧光定量反转录聚合酶链反应从质粒基因、基因组外源性基因位点和内源性基因位点三个层次评估dCasMINI系统在哺乳动物细胞中的转录抑制效果,并进一步设计和比较6种dCasMINI-CRISPRi工具(dCasMINI、dCasMINI-ZIM3 KRAB、dCasMINI-KRAB-MeCP2、dCasMINI-ZNF324 KRAB、dCasMINI-3x KRAB和dCasMINI-Com-KRAB-MeCP2)和不同位置单链引导RNA(single guide RNA, sgRNA)的转录抑制效果。结果 dCasMINI、dCasMINI-ZIM3 KRAB、dCasMINI-KRAB-MeCP2、dCasMINI-ZNF324 KRAB、dCasMINI-3x KRAB和dCasMINI-Com-KRAB-MeCP2能够不同程度地抑制质粒基因、基因组外源性基因的转录(P<0.05);dCasMINI-ZIM3 KRAB、dCasMINI-KRAB-MeCP2、dCasMINI-ZNF324 KRAB和dCasMINI-Com-KRAB-MeCP2能够不同程度地抑制内源性基因的转录(P<0.05);不同结合位点的sgRNA具有不同的转录抑制效果(P<0.05)。结论 CasMINI系统能够改造成多种CRISPRi工具进行基因敲降研究,未来有望应用在多个场景,如原代细胞表观基因编辑、体内筛选和临床治疗等。
成簇的规律间隔的短回文重复序列及CRISPR相关蛋白(clustered regularly intersected short palindromic repeats and CRISPR associated proteins, CRISPR-Cas)系统,是遍布于细菌和古菌中的一种获得性免疫机制[1]。CRISPR干扰(CRISPR interference, CRISPRi)是基于CRISPR系统开发出来的[2], 该系统包括去活化的Cas9蛋白(deactivited Cas9, dCas9)和单链引导RNA(single guide RNA, sgRNA)[2],二者形成的复合体 sgRNA-dCas9与靶位点特异性结合,进而干扰相应基因的转录延伸、RNA聚合酶或转录因子的结合[2]。为进一步提高CRISPRi的转录抑制效果和拓展其应用场景,CRISPRi工具的多种优化策略陆续被报道,包括将dCas9与转录抑制结构域直接融合或利用RNA适配体募集转录抑制结构域 [3,4,5,6]。
虽然Streptococcus pyogenes Cas9(SpCas9)是目前研究与应用最广泛的Cas蛋白,但是较大的蛋白分子量(1 367个氨基酸)限制其临床应用,特别是使用腺相关病毒(adeno-associated virus, AAV)这一类载量有限的载体(小于4.7 Kb)[7]。因此Cas12f家族(400~700个氨基酸)这一类紧凑Cas蛋白获得诸多关注[8]。2021年,有研究显示通过改造UniCas12f系统获得CasMINI(528个氨基酸),并验证去活化的CasMINI蛋白(deactivated CasMINI,dCasMINI)在哺乳动物细胞中的高效转录激活效果[7]。但是关于dCasMINI的转录抑制效果目前尚无文献报道。
1、材料与方法
1.1 材料
人胚肾细胞系HEK293T(中国医学科学院血液病医院生物样本库);TRE3G-GFP、psPAX2和pCMV-VSV-G(Addgene质粒保藏中心);dCasMINI、sgRNA、Krüppel相关盒(Krüppel-associated box, KRAB)、锌指蛋白324 Krüppel相关盒(zinc finger proteins 324 Krüppel-associated box, ZNF324 KRAB)序列和引物序列(北京擎科生物科技股份有限公司);pEASY®-Basic无缝克隆与组装试剂盒、Trans1-T1噬菌体抗化学感受态细胞、T4连接酶(北京全式金生物技术股份有限公司);胎牛血清、青霉素-链霉素、DMEM 培养基、Opti-MEM减血清培养基和QuantStudio 6 Pro实时荧光定量聚合酶链反应系统(赛默飞世尔科技公司);聚乙烯亚胺(polyethylenimine, PEI)(Polysciences公司);0.45 μm滤器(Pall公司);CantoII流式细胞仪(碧迪医疗器械有限公司);RNA提取试剂盒(山东思科捷生物技术有限公司);反转录试剂盒和定量聚合酶链反应预混液[翌圣生物科技(上海)股份有限公司]。
1.2 方法
1.2.1 质粒构建:
dCasMINI,sgRNA骨架,3x KRAB和ZNF324 KRAB序列直接订购合成。KRAB,锌指印迹3 Krüppel相关盒(zinc finger imprinted 3 Krüppel-associated box, ZIM3 KRAB)和Krüppel相关盒-甲基化CpG结合蛋白2(Krüppel-associated box-methyl-CpG binding protein 2,KRAB-MeCP2)序列分别通过从质粒PCR获得。所有蛋白质载体构建使用pEASY®-Basic无缝克隆与组装试剂盒和Trans1-T1噬菌体抗化学感受态细胞。dCasMINI-ZIM3 KRAB,dCasMINI-KRAB-MeCP2和dCasMINI-ZNF324 KRAB的转录抑制结构域与dCasMINI直接融合,dCasMINI-Com-KRAB-MeCP2的转录抑制结构域则通过融合表达的Com蛋白被sgRNA中的发夹结构com募集(图1A)。所有sgRNA质粒克隆构建使用T4连接酶连接。用于sgRNA的间隔区序列(spacer)通过退火并连接到酶切载体骨架。本文中所用spacer序列见表1。
1.2.2 细胞培养:
HEK293T和TRE3G-GFP HEK293T细胞使用含有10%胎牛血清和1%青霉素-链霉素的DMEM培养基,置于37 ℃和5% CO2的培养箱培养,并确保细胞汇合度不超过80%。质粒转染使用PEI并根据说明书转染。转染前1天在24孔细胞培养板中以1×105个细胞/孔均匀接种细胞。在tet-on系统评估dCasMINI系统对质粒基因表达的转录抑制实验中,每孔转染500 ng dCasMINI融合蛋白(和Com-KRAB-MeCP2)、500 ng sgRNA和500 ng TRE3G-GFP质粒。在tet-on系统评估dCasMINI系统对基因组外源性基因表达的转录抑制实验中,每孔转染800 ng dCasMINI融合蛋白(和Com-KRAB-MeCP2)和800 ng sgRNA质粒。在评估CasMINI系统对内源性基因表达的转录抑制实验中,每孔转染800 ng dCasMINI融合蛋白(和Com-KRAB-MeCP2)和800 ng sgRNA质粒。对于tet-on 系统,转染24 h后将培养基更换为含有1 μg/mL多西环素(doxycycline, dox)的完全DMEM培养基;转染72 h后收集细胞使用流式细胞测量术分析。对于内源性基因位点实验,转染24 h后将培养基更换为含有3 μg/mL嘌呤霉素的完全DMEM培养基,转染72 h后裂解细胞提取RNA。
表1 Spacer序列
1.2.3 慢病毒制备:
用完全DMEM将8×106 HEK293T细胞均匀种植在10 cm培养皿,24 h后将培养基更换为Opti-MEM减血清培养基。使用PEI将9 μg穿梭质粒TRE3G-GFP、6 μg包装质粒psPAX2和3 μg包膜质粒pCMV-VSV-G共转染到HEK293T细胞。转染10 h后将培养基更换为完全DMEM培养基;转染48 h后将收集病毒上清液,并使用0.45 μm滤器过滤,并冷冻于-80 ℃。
1.2.4 流式细胞测量术:
在tet-on系统实验中,质粒转染72 h后使用0.125%胰蛋白酶消化细胞,将细胞重悬于含有2%胎牛血清的磷酸盐缓冲液(phosphate buffered saline, PBS), 使用CantoII流式细胞仪检测GFP的中位荧光强度(median fluoresc-ence intensity, MFI)。使用FlowJo软件分析检测结果。
1.2.5 实时荧光定量反转录聚合酶链反应(quantita-tive reverse transcription polymerase chain, RT-qPCR):
使用0.125%胰蛋白酶消化液收获上述内源性基因实验转染细胞,并使用RNA 提取试剂盒提取总RNA。使用反转录试剂盒制备cDNA,并在-80 ℃下储存。使用定量聚合酶链反应预混液在384孔板中制备反应,并在QuantStudio 6 Pro实时荧光定量聚合酶链反应系统上运行。用非靶向sgRNA质粒转染的样品用作阴性对照。使用ΔΔCq方法分析相对表达倍数变化;使用GAPDH作为内参基因。所需引物:CXCR4上游引物5′ -ACTACACCGAGGAAATGG GCT-3′,下游引物5′-CCCACAATGCCAGTTAAGAAGA-3′;GAPDH上游引物5′ - ACCCAGAAGACTGTGGATGG-3′,下游引物5′- TTCAGCTCAGGGATGACCTT-3′。
1.3 统计学分析
RT-qPCR显示了生物学样本中合并的所有技术重复样本 (每个生物样品有3个技术重复样本)。使用Graphpad Prism 9用于统计分析,若实验数据服从正态分布,两组数据之间使用非配对t检验,多组数据之间比较采用One Way-Anova进行分析;否则用非参数秩和检验分析实验数据。计量资料以均值±标准误差表示,P<0.05即认为具有统计学意义(*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001,****P<0.000 1),P≥0.05则认为不具有统计学意义(not significant, ns)。使用Adobe Illustrator 2023和Graphpad Prism 9绘制图片和表格。
2、结果
2.1 dCasMINI对质粒基因的表达有较强的转录抑制效果
采用四环素诱导基因开启系统(tetracycline-on, tet-on)来评估dCasMINI对于哺乳动物细胞中质粒基因表达的转录抑制效果(图1B~D)。设计dCasMINI、dCasMINI-ZIM3 KRAB、dCasMINI-KRAB-MeCP2、dCasMINI-ZNF324 KRAB、dCasMINI-3x KRAB和dCasMINI-Com-KRAB-MeCP2 6种CRISPRi工具来评估不同的转录抑制结构域或转录抑制结构域的募集方式对于dCasMINI的转录抑制效果的影响,以及针对诱导表达基因GFP转录起始位点(transcription start site, TSS)附近区域、上游启动子CMVmin(cytomegalovirus)和操纵子四环素应答元件(tet-responsive element third generation, T3G)共设计5条sgRNA来评估对于不同位置的sgRNA对于dCasMINI的转录抑制效果的影响(图2A)。
除了dCasMINI在sg2位点无显著转录抑制效果外,其余29种组合均可对质粒基因GFP的表达水平实现不同程度转录抑制效果(图2A)。其中,dCasMINI在sg5位点对GFP的敲降效果可以达到54.3%;dCasMINI-ZIM3 KRAB在sg1位点对GFP的敲降效果可以达到61.2%;dCasMINI-KRAB-MeCP2在sg2位点对GFP的敲降效果可以达到 57.9%;dCasMINI-ZNF324 KRAB在sg1位点对GFP的敲降效果可以达到63.4%;dCasMINI-3x KRAB在sg1位点对GFP的敲降效果可以达到61.4%;dCasMINI-Com-KRAB-MeCP2在sg1位点对GFP的敲降效果可以达到61.2%(图2A)。另外,dCasMINI CRISPRi系统在不同位点的转录抑制效果具有一定的波动性,其中dCasMINI在sg2和sg5位点对GFP的敲降效果相差46.8%;dCasMINI-ZIM3 KRAB在sg1和sg5位点对GFP的敲降效果相差22.5%;dCasMINI-ZNF324 KRAB在sg1和sg4位点对GFP的敲降效果相差37.7%;dCasMINI-3x KRAB在sg1和sg5位点对GFP的敲降效果相差32.5%。而dCasMINI-KRAB-MeCP2和dCasMINI-Com-KRAB-MeCP2呈现相对较好的稳定性,其中dCasMINI-KRAB-MeCP2在sg2和sg4位点对GFP的敲降效果仅相差9.9%;dCasMINI-Com-KRAB-MeCP2在sg1和sg3位点对GFP的敲降效果仅相差13.3%(图2A)。
2.2 dCasMINI可实现对基因组外源性基因的转录抑制效果
由于质粒整体结构和环境较为简单,为了进一步评估dCasMINI在哺乳动物细胞复杂基因组环境下的转录抑制效果,仍采用tet-on系统来评估dCasMINI对于哺乳动物细胞中基因组外源性基因位点的转录抑制效果(图1B~D)。与评估dCasMINI对质粒基因表达的转录抑制效果的策略一致,利用上文设计的6种 CRISPRi策略来评估不同的转录抑制结构域或转录抑制结构域的募集方式对于dCasMINI 的转录抑制效果的影响,以及5条sgRNA来评估对于不同位置的sgRNA对于dCasMINI 的转录抑制效果的影响(图2B)。
图1 dCasMINI CRISPRi结构和tet-on系统示意图
多种CRISPRi组合均可对基因组外源性基因位点GFP的表达水平实现不同程度转录抑制效果,但是整体转录抑制效果低于质粒水平(图2B)。其中,dCasMINI在sg5位点对GFP的敲降效果可以达到25.7%;dCasMINI-ZIM3 KRAB在sg1位点对GFP的敲降效果可以达到36.2%;dCasMINI-KRAB-MeCP2在sg1位点对GFP的敲降效果可以达到25.3%;dCasMINI-ZNF324 KRAB在sg1位点对GFP的敲降效果可以达到28.2%;dCasMINI-3x KRAB在sg1位点对GFP的敲降效果可以达到19.7%;dCasMINI-Com-KRAB-MeCP2在sg1位点对GFP的敲降效果可以达到42.2%(图2B)。另外,dCasMINI CRISPRi系统在不同位点的转录抑制效果具有一定的波动性,其中dCasMINI在sg2和sg5位点对GFP的敲降效果相差20.7%;dCasMINI-ZIM3 KRAB在sg1和sg2位点对GFP的敲降效果相差30.6%;dCasMINI-ZNF324 KRAB在sg1和sg2位点对GFP的敲降效果相差28.8%;dCasMINI-3x KRAB在sg1和sg5位点对GFP的敲降效果相差32.5%。而dCasMINI-KRAB-MeCP2和dCasMINI-Com-KRAB-MeCP2呈现相对较高的稳定性,其中dCasMINI-KRAB-MeCP2在sg1和sg5位点对GFP的敲降效果相差17.2%;dCasMINI-Com-KRAB-MeCP2在sg1和sg5位点对GFP的敲降效果相差16.7%(图2B)。
2.3 dCasMINI可实现对内源性基因位点表达的转录抑制效果
为拓展CasMINI系统在CRISPRi的应用场景,进一步评估了dCasMINI对哺乳动物细胞内源性基因位点CXCR4的转录抑制效果。利用上文设计的dCasMINI-ZIM3 KRAB、dCasMINI-KRAB-MeCP2、dCasMINI-ZNF324 KRAB和dCasMINI-Com-KRAB-MeCP2 4种 CRISPRi工具来评估不同的转录抑制结构域或转录抑制结构域的募集对于dCasMINI的转录抑制效果的影响,以及针对TSS附近区域设计6条sgRNA来评估对于不同位置的sgRNA对于dCasMINI 的转录抑制效果的影响。
在上述24种组合中,多种组合显示了不同程度的敲降效果(图3)。其中,dCasMINI-ZIM3 KRAB有3条sgRNA具有转录抑制效果,在sg3位点对CXCR4的敲降效果可以达到61.8%;而dCasMINI-KRAB-MeCP2 6条sgRNA均无显著转录抑制效果;dCasMINI-ZNF324 KRAB有1条sgRNA具有转录抑制效果,在sg6位点对CXCR4的敲降效果可以达到26.7%;dCasMINI-Com-KRAB-MeCP2有5条sgRNA均具有转录抑制效果,在sg3位点对CXCR4的敲降效果可以达到60.0%(图3)。
3、讨论
从质粒基因、基因组外源性基因和内源性基因三个层面验证dCasMINI系统能够在哺乳动物细胞中实现转录抑制效果,并进一步设计和比较多种dCasMINI CRISPRi工具和不同sgRNA的转录抑制效果。总体来看,dCasMINI系统对于质粒基因表达有更强的敲降效果,与之前文献报道结果一致[9],这可能与质粒结构较为简单,不涉及染色质的可及性等有关[10]。而无论是在tet-on系统、内源性基因位点以及不同的sgRNA位点,dCasMINI-Com-KRAB-MeCP2有着较为稳健的转录抑制能力。与其他将转录抑制结构域融合在dCasMINI C端的CRISPRi系统不同的是,dCasMINI-Com-KRAB-MeCP2则是通过sgRNA的com发夹序列,进而募集Com-KRAB-MeCP2[4]。CasMINI是一种以二聚体形式行使功能的Cas蛋白[11], 因此, 直接将转录抑制结构域融合在dCasMINI的C端,可能会影响其与DNA的结合能力。在使用tet-on 系统进行评估时,靶向TRE3G位点的sg1整体上敲降效果较佳,这可能与TRE3G由7段重复四环素操纵子序列(tetracycline operator, tetO)有关,能够提高局部的转录抑制因子浓度进而提高敲降效率[12]。而对于同一种CRISPRi系统而言,不同的sgRNA会出现相差较大的转录抑制效果,甚至部分sgRNA没有转录抑制能力,这提示sgRNA的选择是一个影响CRISPRi效能的重要参数。
相比于SpCas9识别3′-NGG 前间区序列邻近基序(protospacer adjacent motif, PAM),CasMINI识别的是5′-TTTR,基因组上的部分位点会较大程度地限制CasMINI对于sgRNA选择,进而影响其CRISPRi效能。因此后续研究可以考虑根据CasMINI结构特点和利用蛋白质定向进化工程拓宽CasMINI的PAM识别范围。与此同时,虽然验证了dCasMINI-Com-KRAB-MeCP2在6种CRISSPRi系统中具有较为稳健的敲降效能,但是使用其他RNA发夹结构,如MS2,PP7这类能够结合两个RNA结合蛋白的RNA适体[4],去募集转录抑制结构域是否具有更高的敲降效能仍然值得进一步探索。此外,如前文所提及,sgRNA的选择是一个影响CRISPRi的重要参数,利用大规模的文库筛选和生物信息学技术等手段为CasMINI的sgRNA的选择提供指导也显得尤为重要。
图2 Tet-on系统评估dCasMINI对质粒基因和基因组外源性基因转录抑制效果
图3 评估dCasMINI对内源性基因CXCR4转录抑制效果
总之,我们首次从质粒基因、基因组外源性基因和内源性基因三个层次验证了dCasMINI能够在哺乳动物细胞中实现转录抑制效果,提示dCasMINI-CRISPRi 未来有望应用在多个场景,如原代细胞表观基因编辑、体内筛选和临床治疗等,但是目前CasMINI仍然面临一些不可忽视和亟待解决的挑战需要进一步解决。
基金资助:天津市自然科学基金(21JCQNJC01220);
文章来源:陈信文,曹佳璇,饶书权.基于dCasMINI蛋白的CRISPRi工具设计及其效果探究[J].基础医学与临床,2024,44(06):821-827.
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2024-05-31我要评论
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