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髓系白血病患儿柔红霉素耐药与PD-L1蛋白表达相关

2024-05-31 12 上传者：管理员

摘要：目的研究急性髓系白血病(AML)患儿柔红霉素(DNR)耐药与程序性死亡受体配体-1(PD-L1)蛋白表达的相关性。方法选取2016年1月至2022年12月郑州大学附属儿童医院收治的110例AML患儿骨髓样本作为研究组，以50名骨髓正常供体骨髓样本作为对照组。培养人AML细胞系HL60、THP-1、U-937、Molm-13,Western blot检测PD-L1蛋白表达量。构建LV-PD-L1-shRNA、LV-PD-L1-WT-OE慢病毒载体，分析PD-L1对Molm-13细胞DNR耐药的影响及机制。结果研究组PD-L1蛋白表达量高于对照组，AML细胞系中PD-L1蛋白表达量高于健康骨髓单个核细胞(BMMC)(P<0.05),PD-L1表达与AML患儿白细胞计数、骨髓原始细胞比率、预后危险分层、两个标准化学治疗方案后疾病缓解情况有关(P<0.05)。PD-L1高表达组总生存率低于PD-L1低表达组(P<0.05)。与LV-PD-L1-WT-OE组比较，LV-PD-L1-shRNA组PD-L1 mRNA表达量降低、细胞增殖活性降低、凋亡率升高(P<0.05),LV-PD-L1-shRNA可提高Molm-13细胞对DNR的敏感性。TCGA数据库分析显示，6-磷酸葡萄糖脱氢酶(G6PD)可能为PD-L1潜在的目标基因。结论 PD-L1在儿童AML中高表达，与患儿化疗耐药有关，其可能通过调控G6PD引起DNR耐药。

关键词：
AML
儿童急性髓系白血病
柔红霉素
程序性死亡受体配体-1
耐药
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急性髓系白血病(acute myeloid leukemia, AML)是一种髓系造血干细胞或者祖细胞的恶性疾病，占儿童急性白血病的15%～20%,柔红霉素(daunorubicin, DNR)是治疗AML的一线用药，尽管大部分患儿经DNR治疗实现了初始诱导缓解，但化学治疗耐药仍是治疗失败的关键因素。因此，探寻儿童AML化疗耐药的潜在机制和治疗新策略尤为重要[1]。程序性死亡受体配体-1(programmed death receptor ligand 1,PD-L1)是一种大量表达于恶性肿瘤的蛋白，与受体结合后抑制T细胞活化信号，帮助肿瘤细胞逃避免疫监视介导细胞耐药[2]。虽然PD-L1与AML预后有关[3],但其是否与AML患儿DNR耐药有关尚不知晓，本研究探讨PD-L1与AML患儿DNR耐药的关系及机制，以期改善患儿预后。

1、材料与方法

1.1 材料

1.1.1 研究对象：

选取2016年1月至2022年12月郑州大学附属儿童医院收治的110例初次确诊为AML的患儿的骨髓样本作为研究组，以同期保存的50名正常供体骨髓样本作为健康组。研究组男57例，女53例，年龄5～14岁，平均(9.4±1.2)岁，对照组男26例，女24例，年龄5～15岁，平均(9.5±1.4)岁，两组性别、年龄差异无统计学意义，具有可比性。本次研究获得郑州大学附属儿童医院伦理委员会批准(QBH20201209),骨髓样本采集时患儿家属签署知情同意书。纳入标准：研究组儿童AML诊断[4],经骨髓形态学、细胞组织化学染色、分子生物学、细胞免疫分型确诊；入院后均行CCLG-AML-2015方案(包括2个疗程的诱导治疗+3～4个疗程的巩固治疗+1年的维持治疗)[5]治疗。同期保存的对照组骨髓样本无异常。排除标准：急性早幼粒细胞白血病；继发性AML;呼吸系统障碍者；先天性免疫缺陷者；长期使用免疫抑制剂者。

1.1.2 细胞及试剂：

人AML细胞系HL60、THP-1、U-937、Molm-13均美国典型生物资源胞藏中心(ATCC)提供并在本实验室长期保存；ECL发光试剂盒(Millipore公司);RPMI-1640培养基(Gibco公司);PD-L1慢病毒包装(上海吉玛有限公司);LipofectamineTM2000转染试剂盒(Inxitrogen公司);MTT试剂(浙江麦飞生物科技有限公司);TUNEL试剂盒(武汉纯度生物科技有限公司);DNR(Selleck生物科技有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 Western blot检测PD-L1蛋白表达：

取两组骨髓样本置于EDTA_K2管内，使用红细胞裂解液提取两组骨髓样本中骨髓单个核细胞(bone marrow mononuclear cells, BMMC)[6]。取所分离的BMMC和人AML细胞系HL60、THP-1、U-937、Molm-13提取细胞总蛋白质，SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳、转膜、封闭，加入1∶1 000稀释的PD-L1、GAPDH内参一抗，4 ℃孵育过夜，加入1∶4 000稀释的二抗，室温孵育120 min, 滴加ECL,在Bio-Rad化学发光成像系统拍照，使用ImageJ软件扫描吸光度，获得PD-L1表达量。

1.2.2 Molm-13细胞分组及处理：

将Molm-13细胞置于含胎牛血清的RPMI-1640培养液中，37 ℃、5% CO2下培养。取对数期增殖的Molm-13细胞，以1×105个/mL接种于6孔板，培养24 h后分为对照组、LV-PD-L1-shRNA组(PD-L1沉默)、LV-PD-L1-WT-OE组(PD-L1过表达),当细胞汇合率达50%时LV-PD-L1-shRNA组、LV-PD-L1-WT-OE组使用LipofectamineTM2000转染试剂盒包装慢病毒，每孔中加100 μL的慢病毒悬液、DMEM培养液，使用荧光显微镜筛选稳定表达的Molm-13细胞株，若镜下观察到Molm-13细胞膜上有均匀分布的黄绿色荧光即为稳定表达的Molm-13细胞株。

1.2.3 RT-qPCR检测PD-L1mRNA表达量：

Molm-13细胞感染24 h后使用RT-qPCR法检测细胞中PD-L1 mRNA表达量，以cDNA为模板，配制PCR扩增体系：上下游引物各0.4 μL、1 μL cDNA模板、10 μL SYBR Green, 加蒸馏水至20 μL,条件：94 ℃预变性1 min; 94 ℃变性1min; 55 ℃ 1 min、72℃ 1 min, 72 ℃延伸5 min, 40个循环，以β-actin作为内参，采用2-△△Ct法计算PD-L1表达量。PD-L1上游引物5′-AACTACCTCTGGCACATCCTCC-3′,下游引物5′-CATCCATCATTCTCCCTTTTCTT-3′,β-actin上游引物5′-CATGTACGTTGCTATCCAGGC-3′,下游引物5′-CTCCTTAATGTCACGCACGAT-3′。

1.2.4 Molm-13细胞增殖、凋亡的检测：

MTT法检测Molm-13细胞增殖活性，以3×104个/mL接种于96孔板，37 ℃培养72 h, 加入MTT试剂，使用酶标仪在OD 450 nm处检测各孔吸光(A)值，绘制生存曲线。TUNEL法测定Molm-13细胞凋亡，洗涤细胞、使用4′,6-二脒基-2-苯基吲哚染色，封片后利用荧光显微镜观察细胞核颜色(绿色阳性)。

1.2.5 Molm-13细胞DNR敏感性检测：

细胞胰蛋白酶消化后接种于96孔板上，加入0、2、4、8、16 mmol/L浓度的DNR,每个浓度设置3个复孔，并设置对照组孔、调零孔，使用MTT法检测A值，计算细胞增殖率，绘制细胞存活曲线，增殖率=(细胞组A值/对照组A值)×100%。

1.2.6 PD-L1影响Molm-13细胞DNR耐药的机制分析：

经GEPIA网站利用TCGA公开的测序结果数据分析以PD-L1关联基因，筛选出PCC>0.6表示两个基因可能为上下游关系，发现在AML中G6PD基因作为PD-L1的靶基因，使用RT-PCR检测G6PD mRNA表达量，行双荧光素酶报告实验。经Targetscan软件预测PD-L1的可能作用靶点，PD-L1与G6PD 3′非编码区之间存在互补配对，建立MUT-G6PD、WT-G6PD的G6PD 3′-UTR双荧光素酶报告基因载体。使用LipofectamineTM2000将LV-PD-L1-WT-OE、LV-PD-L1-shRNA、G6PD-MUT、G6PD-WT共转染至Molm-13细胞，测定荧光素酶活性。

1.3 统计学分析

用SPSS22.0统计软件进行分析处理。计量资料采用均数±标准差表示，组间比较采用独立样本t检验，组内不同时间采用重复测量方差(Repeated-Measures Anova)分析；计数资料采用频数和百分比表示，组间比较采用χ2检验，采用受试者工作特征(receiver operating characteristic, ROC)曲线分析预测价值，采用Kapian-Meier检验进行生存期分析。

2、结果

2.1 PD-L1蛋白的表达比较

研究组PD-L1蛋白表达量高于健康组(P<0.05)(图1A)。AML细胞系中PD-L1蛋白表达量高于正常BMMC(P<0.05)(图1B)。

2.2 PD-L1蛋白诊断儿童AML的ROC曲线分析

PD-L1诊断儿童AML的曲线下面积为0.802(95% CI:0.723～0.843),当PD-L1取2.13时获得最佳诊断效能，此时敏感度为80.32%,特异度为75.77%(图2)。

2.3 PD-L1与AML患儿临床病例特征的关系

以ROC曲线最佳截断值2.13为界，将AML患儿分为PD-L1高表达组(≥2.13,n=78)、PD-L1低表达组(<2.13,n=32),PD-L1表达与AML患儿白细胞计数、骨髓原始细胞比率、预后危险分层、两个标准化学治疗方案(柔红霉素+阿糖胞苷+依托泊苷/高三尖杉酯碱与去甲氧柔红霉素+阿糖胞苷+依托泊苷/高三尖彬酯碱)后疾病缓解情况有关(P<0.05)(表1)。

2.4 PD-L1与AML患儿预后生存的关系

110例AML患儿随访6～36个月，中位随访23个月，无失访，死亡36例，36个月总生存率为67.27%(74/110),Kapian-Meier生存曲线分析结果显示，PD-L1高表达组总生存率为60.26%(47/78)低于PD-L1低表达组的84.38%(27/32)(P<0.05)(图3)。

图1 两组骨髓样本和AML细胞系中PD-L1蛋白表达图

图2 PD-L1诊断儿童AML的ROC曲线

表1 PD-L1与AML患儿临床病理特征的关系

图3 PD-L1高表达与低表达AML患儿Kapian-Meier 生存曲线

2.5 Molm-13细胞PD-L1表达分析

与对照组比较，LV-PD-L1-WT-OE组PD-L1 mRNA表达量升高(P<0.05);与LV-PD-L1-WT-OE组比较，LV-PD-L1-shRNA组PD-L1 mRNA表达量降低(P<0.05)(图4)。

2.6 Molm-13细胞增殖、凋亡分析

与对照组比较，LV-PD-L1-WT-OE组细胞增殖活性升高、凋亡率降低(P<0.05);与LV-PD-L1-WT-OE组比较，LV-PD-L1-shRNA组细胞增殖活性降低、凋亡率升高(P<0.05)(图5,6)。

图4 各组细胞中PD-L1表达比较

图5 Molm-13细胞各时间点增殖活性比较

2.7 Molm-13细胞DNR敏感性分析

与对照组、LV-PD-L1-WT-OE组比较，LV-PD-L1-shRNA组AML细胞系Molm-13存活率显著降低(P<0.05)(图7)。

2.8 PD-L1影响Molm-13细胞DNR耐药性的机制分析

PD-L1与G6PD基因正相关(P<0.05)(图8A)。与对照组比较，LV-PD-L1-WT-OE组G6PD表达量升高(P<0.05);与LV-PD-L1-WT-OE组比较，LV-PD-L1-shRNA组G6PD表达量降低(P<0.05)(图8B)。PD-L1与G6PD基因存在互补序列(图8C)。

PD-L1荧光素酶活性降低，PD-L1-WT的荧光素酶活性改变，PD-L1表达降低(图8D)。

3、讨论

由于DNR耐药，大部分AML患儿仍存在较高复发风险，因此有必要对AMI耐药机制进行研究，以提高DNR治疗儿童AMI的临床疗效。

PD-L1又被称为CD274、B7-h1,定位于9p24,由290个氨基酸组成，广泛表达于免疫细胞、上皮细胞、内皮细胞及肿瘤细胞中，在肿瘤微环境中，肿瘤细胞膜蛋白中PD-L1与表达于T细胞的PD-1结合后激活PD-1/PD-L1信号，在T细胞募集作用下，促进PD-1胞内结构磷酸化，阻断T细胞下游信号，刺激调节性T细胞、细胞毒性T细胞，引起效应免疫反应，与LV-PD-L1-WT-OE组比较，LV-PD-L1-shRNA共转染的Molm-13细胞中，目前已经证实在AMI中表达升高[7,8,9]。本研究发现PD-L1在AMI患儿BMMC及AMI细胞中表达升高，且与两个标准化学治疗方案(柔红霉素+阿糖胞苷+依托泊苷/高三尖杉酯碱与去甲氧柔红霉素+阿糖胞苷+依托泊苷/高三尖彬酯碱)实施后疾病缓解情况有关，提示PD-L1可能参与AMI发生及治疗转归，与上述研究一致。在小鼠AML模型中， PD-L1呈高表达状态，发现PD-L1缺失后完全丧失了白血病起始细胞的致白血病能力，延长了AML小鼠的生长周期[10]。

图6 Molm-13细胞凋亡率比较

图7 PD-L1对Molm-13细胞存活率的影响

本研究中体外培养AML Molm-13细胞，分析PD-L1表达升高和缺失对Molm-13细胞增殖、凋亡及DNR耐药性的影响，结果显示，与过表达PD-L1处理的细胞比较，做沉默处理的细胞增殖率明显降低，凋亡率升高，且可提高DNR敏感性，降低耐药性。此结果提示着，PD-L1与AML化疗耐药有关。

虽然沉默PD-L1表达可降低AMI细胞DNR耐药性，但具体机制尚不可知，近年来研究显示[11],AML耐药时包括磷酸戊糖途径(pentose phosphate pathway, PPP)的内源性代谢谱随之改变，PD-L1刺激的细胞通过增加G6PD和HK-2的表达而影响戊糖磷酸途径和糖酵解，从而参与AML耐药。本研究使用生物信息学方法分析PD-L1的潜在靶点，结果发现， PD-L1与G6PD存在互补位点，且双荧光素酶报告基因实验表明，G6PD是PD-L1的直接靶标基因，提示PD-L1可能经PPP途径调控G6PD表达而参与AML耐药过程。

本研究仍存在以下不足：1)并未进一步阐明PD-L1与G6PD在儿童AMI中的具体机制；2)未分析PD-L1除参与DNR耐药外与其他药物耐药的关系，因此，还需后续进一步深入研究。

综上所述，PD-L1在儿童AML中高表达，与患儿化疗耐药有关，其可能经过调控G6PD引起DNR耐药。

图8 PD-L1与G6PD之间相关性

参考文献:

[4]中华医学会儿科学分会血液学组,《中华儿科杂志》编辑委员会.儿童急性髓细胞白血病诊疗建议[J].中华儿科杂志,2006,44:877-878.

[5]王平,熊昊,李建新,等.CCLG-AML-2015方案治疗儿童急性髓系白血病的临床分析[J].中国实验血液学杂志,2022,30:373-380.

[6]孙林,周旭,章体玲,等.骨髓单个核细胞的提取､分离､标记和体外培养[J].中国心血管病研究杂志,2008,6:777-779.

基金资助:2021年度河南省科技攻关计划项目(212102310036);

文章来源:宋丽丽,管玉洁,马平,等.急性髓系白血病患儿柔红霉素耐药与PD-L1蛋白表达相关[J].基础医学与临床,2024,44(06):833-839.