![](/static/index/images/icon-home.png)
摘要:目的 研究急性髓系白血病(AML)患儿柔红霉素(DNR)耐药与程序性死亡受体配体-1(PD-L1)蛋白表达的相关性。方法 选取2016年1月至2022年12月郑州大学附属儿童医院收治的110例AML患儿骨髓样本作为研究组,以50名骨髓正常供体骨髓样本作为对照组。培养人AML细胞系HL60、THP-1、U-937、Molm-13,Western blot检测PD-L1蛋白表达量。构建LV-PD-L1-shRNA、LV-PD-L1-WT-OE慢病毒载体,分析PD-L1对Molm-13细胞DNR耐药的影响及机制。结果 研究组PD-L1蛋白表达量高于对照组,AML细胞系中PD-L1蛋白表达量高于健康骨髓单个核细胞(BMMC)(P<0.05),PD-L1表达与AML患儿白细胞计数、骨髓原始细胞比率、预后危险分层、两个标准化学治疗方案后疾病缓解情况有关(P<0.05)。PD-L1高表达组总生存率低于PD-L1低表达组(P<0.05)。与LV-PD-L1-WT-OE组比较,LV-PD-L1-shRNA组PD-L1 mRNA表达量降低、细胞增殖活性降低、凋亡率升高(P<0.05),LV-PD-L1-shRNA可提高Molm-13细胞对DNR的敏感性。TCGA数据库分析显示,6-磷酸葡萄糖脱氢酶(G6PD)可能为PD-L1潜在的目标基因。结论 PD-L1在儿童AML中高表达,与患儿化疗耐药有关,其可能通过调控G6PD引起DNR耐药。
急性髓系白血病(acute myeloid leukemia, AML)是一种髓系造血干细胞或者祖细胞的恶性疾病,占儿童急性白血病的15%~20%,柔红霉素(daunorubicin, DNR)是治疗AML的一线用药,尽管大部分患儿经DNR治疗实现了初始诱导缓解,但化学治疗耐药仍是治疗失败的关键因素。因此,探寻儿童AML化疗耐药的潜在机制和治疗新策略尤为重要[1]。程序性死亡受体配体-1(programmed death receptor ligand 1,PD-L1)是一种大量表达于恶性肿瘤的蛋白,与受体结合后抑制T细胞活化信号,帮助肿瘤细胞逃避免疫监视介导细胞耐药[2]。虽然PD-L1与AML预后有关[3],但其是否与AML患儿DNR耐药有关尚不知晓,本研究探讨PD-L1与AML患儿DNR耐药的关系及机制,以期改善患儿预后。
1、材料与方法
1.1 材料
1.1.1 研究对象:
选取2016年1月至2022年12月郑州大学附属儿童医院收治的110例初次确诊为AML的患儿的骨髓样本作为研究组,以同期保存的50名正常供体骨髓样本作为健康组。研究组男57例,女53例,年龄5~14岁,平均(9.4±1.2)岁,对照组男26例,女24例,年龄5~15岁,平均(9.5±1.4)岁,两组性别、年龄差异无统计学意义,具有可比性。本次研究获得郑州大学附属儿童医院伦理委员会批准(QBH20201209),骨髓样本采集时患儿家属签署知情同意书。纳入标准:研究组儿童AML诊断[4],经骨髓形态学、细胞组织化学染色、分子生物学、细胞免疫分型确诊;入院后均行CCLG-AML-2015方案(包括2个疗程的诱导治疗+3~4个疗程的巩固治疗+1年的维持治疗)[5]治疗。同期保存的对照组骨髓样本无异常。排除标准:急性早幼粒细胞白血病;继发性AML;呼吸系统障碍者;先天性免疫缺陷者;长期使用免疫抑制剂者。
1.1.2 细胞及试剂:
人AML细胞系HL60、THP-1、U-937、Molm-13均美国典型生物资源胞藏中心(ATCC)提供并在本实验室长期保存;ECL发光试剂盒(Millipore公司);RPMI-1640培养基(Gibco公司);PD-L1慢病毒包装(上海吉玛有限公司);LipofectamineTM2000转染试剂盒(Inxitrogen公司);MTT试剂(浙江麦飞生物科技有限公司);TUNEL试剂盒(武汉纯度生物科技有限公司);DNR(Selleck生物科技有限公司)。
1.2 方法
1.2.1 Western blot检测PD-L1蛋白表达:
取两组骨髓样本置于EDTA_K2管内,使用红细胞裂解液提取两组骨髓样本中骨髓单个核细胞(bone marrow mononuclear cells, BMMC)[6]。取所分离的BMMC和人AML细胞系HL60、THP-1、U-937、Molm-13提取细胞总蛋白质,SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳、转膜、封闭,加入1∶1 000稀释的PD-L1、GAPDH内参一抗,4 ℃孵育过夜,加入1∶4 000稀释的二抗,室温孵育120 min, 滴加ECL,在Bio-Rad化学发光成像系统拍照,使用ImageJ软件扫描吸光度,获得PD-L1表达量。
1.2.2 Molm-13细胞分组及处理:
将Molm-13细胞置于含胎牛血清的RPMI-1640培养液中,37 ℃、5% CO2下培养。取对数期增殖的Molm-13细胞,以1×105个/mL接种于6孔板,培养24 h后分为对照组、LV-PD-L1-shRNA组(PD-L1沉默)、LV-PD-L1-WT-OE组(PD-L1过表达),当细胞汇合率达50%时LV-PD-L1-shRNA组、LV-PD-L1-WT-OE组使用LipofectamineTM2000转染试剂盒包装慢病毒,每孔中加100 μL的慢病毒悬液、DMEM培养液,使用荧光显微镜筛选稳定表达的Molm-13细胞株,若镜下观察到Molm-13细胞膜上有均匀分布的黄绿色荧光即为稳定表达的Molm-13细胞株。
1.2.3 RT-qPCR检测PD-L1mRNA表达量:
Molm-13细胞感染24 h后使用RT-qPCR法检测细胞中PD-L1 mRNA表达量,以cDNA为模板,配制PCR扩增体系:上下游引物各0.4 μL、1 μL cDNA模板、10 μL SYBR Green, 加蒸馏水至20 μL,条件:94 ℃预变性1 min; 94 ℃变性1min; 55 ℃ 1 min、72℃ 1 min, 72 ℃延伸5 min, 40个循环,以β-actin作为内参,采用2-△△Ct法计算PD-L1表达量。PD-L1上游引物5′-AACTACCTCTGGCACATCCTCC-3′,下游引物5′-CATCCATCATTCTCCCTTTTCTT-3′,β-actin上游引物5′-CATGTACGTTGCTATCCAGGC-3′,下游引物5′-CTCCTTAATGTCACGCACGAT-3′。
1.2.4 Molm-13细胞增殖、凋亡的检测:
MTT法检测Molm-13细胞增殖活性,以3×104个/mL接种于96孔板,37 ℃培养72 h, 加入MTT试剂,使用酶标仪在OD 450 nm处检测各孔吸光(A)值,绘制生存曲线。TUNEL法测定Molm-13细胞凋亡,洗涤细胞、使用4′,6-二脒基-2-苯基吲哚染色,封片后利用荧光显微镜观察细胞核颜色(绿色阳性)。
1.2.5 Molm-13细胞DNR敏感性检测:
细胞胰蛋白酶消化后接种于96孔板上,加入0、2、4、8、16 mmol/L浓度的DNR,每个浓度设置3个复孔,并设置对照组孔、调零孔,使用MTT法检测A值,计算细胞增殖率,绘制细胞存活曲线,增殖率=(细胞组A值/对照组A值)×100%。
1.2.6 PD-L1影响Molm-13细胞DNR耐药的机制分析:
经GEPIA网站利用TCGA公开的测序结果数据分析以PD-L1关联基因,筛选出PCC>0.6表示两个基因可能为上下游关系,发现在AML中G6PD基因作为PD-L1的靶基因,使用RT-PCR检测G6PD mRNA表达量,行双荧光素酶报告实验。经Targetscan软件预测PD-L1的可能作用靶点,PD-L1与G6PD 3′非编码区之间存在互补配对,建立MUT-G6PD、WT-G6PD的G6PD 3′-UTR双荧光素酶报告基因载体。使用LipofectamineTM2000将LV-PD-L1-WT-OE、LV-PD-L1-shRNA、G6PD-MUT、G6PD-WT共转染至Molm-13细胞,测定荧光素酶活性。
1.3 统计学分析
用SPSS22.0统计软件进行分析处理。计量资料采用均数±标准差表示,组间比较采用独立样本t检验,组内不同时间采用重复测量方差(Repeated-Measures Anova)分析;计数资料采用频数和百分比表示,组间比较采用χ2检验,采用受试者工作特征(receiver operating characteristic, ROC)曲线分析预测价值,采用Kapian-Meier检验进行生存期分析。
2、结果
2.1 PD-L1蛋白的表达比较
研究组PD-L1蛋白表达量高于健康组(P<0.05)(图1A)。AML细胞系中PD-L1蛋白表达量高于正常BMMC(P<0.05)(图1B)。
2.2 PD-L1蛋白诊断儿童AML的ROC曲线分析
PD-L1诊断儿童AML的曲线下面积为0.802(95% CI:0.723~0.843),当PD-L1取2.13时获得最佳诊断效能,此时敏感度为80.32%,特异度为75.77%(图2)。
2.3 PD-L1与AML患儿临床病例特征的关系
以ROC曲线最佳截断值2.13为界,将AML患儿分为PD-L1高表达组(≥2.13,n=78)、PD-L1低表达组(<2.13,n=32),PD-L1表达与AML患儿白细胞计数、骨髓原始细胞比率、预后危险分层、两个标准化学治疗方案(柔红霉素+阿糖胞苷+依托泊苷/高三尖杉酯碱与去甲氧柔红霉素+阿糖胞苷+依托泊苷/高三尖彬酯碱)后疾病缓解情况有关(P<0.05)(表1)。
2.4 PD-L1与AML患儿预后生存的关系
110例AML患儿随访6~36个月,中位随访23个月,无失访,死亡36例,36个月总生存率为67.27%(74/110),Kapian-Meier生存曲线分析结果显示,PD-L1高表达组总生存率为60.26%(47/78)低于PD-L1低表达组的84.38%(27/32)(P<0.05)(图3)。
图1 两组骨髓样本和AML细胞系中PD-L1蛋白表达图
图2 PD-L1诊断儿童AML的ROC曲线
表1 PD-L1与AML患儿临床病理特征的关系
图3 PD-L1高表达与低表达AML患儿Kapian-Meier 生存曲线
2.5 Molm-13细胞PD-L1表达分析
与对照组比较,LV-PD-L1-WT-OE组PD-L1 mRNA表达量升高(P<0.05);与LV-PD-L1-WT-OE组比较,LV-PD-L1-shRNA组PD-L1 mRNA表达量降低(P<0.05)(图4)。
2.6 Molm-13细胞增殖、凋亡分析
与对照组比较,LV-PD-L1-WT-OE组细胞增殖活性升高、凋亡率降低(P<0.05);与LV-PD-L1-WT-OE组比较,LV-PD-L1-shRNA组细胞增殖活性降低、凋亡率升高(P<0.05)(图5,6)。
图4 各组细胞中PD-L1表达比较
图5 Molm-13细胞各时间点增殖活性比较
2.7 Molm-13细胞DNR敏感性分析
与对照组、LV-PD-L1-WT-OE组比较,LV-PD-L1-shRNA组AML细胞系Molm-13存活率显著降低(P<0.05)(图7)。
2.8 PD-L1影响Molm-13细胞DNR耐药性的机制分析
PD-L1与G6PD基因正相关(P<0.05)(图8A)。与对照组比较,LV-PD-L1-WT-OE组G6PD表达量升高(P<0.05);与LV-PD-L1-WT-OE组比较,LV-PD-L1-shRNA组G6PD表达量降低(P<0.05)(图8B)。PD-L1与G6PD基因存在互补序列(图8C)。
PD-L1荧光素酶活性降低,PD-L1-WT的荧光素酶活性改变,PD-L1表达降低(图8D)。
3、讨论
由于DNR耐药,大部分AML患儿仍存在较高复发风险,因此有必要对AMI耐药机制进行研究,以提高DNR治疗儿童AMI的临床疗效。
PD-L1又被称为CD274、B7-h1,定位于9p24,由290个氨基酸组成,广泛表达于免疫细胞、上皮细胞、内皮细胞及肿瘤细胞中,在肿瘤微环境中,肿瘤细胞膜蛋白中PD-L1与表达于T细胞的PD-1结合后激活PD-1/PD-L1信号,在T细胞募集作用下,促进PD-1胞内结构磷酸化,阻断T细胞下游信号,刺激调节性T细胞、细胞毒性T细胞,引起效应免疫反应,与LV-PD-L1-WT-OE组比较,LV-PD-L1-shRNA共转染的Molm-13细胞中,目前已经证实在AMI中表达升高[7,8,9]。本研究发现PD-L1在AMI患儿BMMC及AMI细胞中表达升高,且与两个标准化学治疗方案(柔红霉素+阿糖胞苷+依托泊苷/高三尖杉酯碱与去甲氧柔红霉素+阿糖胞苷+依托泊苷/高三尖彬酯碱)实施后疾病缓解情况有关,提示PD-L1可能参与AMI发生及治疗转归, 与上述研究一致。在小鼠AML模型中, PD-L1呈高表达状态,发现PD-L1缺失后完全丧失了白血病起始细胞的致白血病能力, 延长了AML小鼠的生长周期[10]。
图6 Molm-13细胞凋亡率比较
图7 PD-L1对Molm-13细胞存活率的影响
本研究中体外培养AML Molm-13细胞,分析PD-L1表达升高和缺失对Molm-13细胞增殖、凋亡及DNR耐药性的影响,结果显示,与过表达PD-L1处理的细胞比较,做沉默处理的细胞增殖率明显降低,凋亡率升高,且可提高DNR敏感性,降低耐药性。此结果提示着,PD-L1与AML化疗耐药有关。
虽然沉默PD-L1表达可降低AMI细胞DNR耐药性,但具体机制尚不可知,近年来研究显示[11],AML耐药时包括磷酸戊糖途径(pentose phosphate pathway, PPP)的内源性代谢谱随之改变,PD-L1刺激的细胞通过增加G6PD和HK-2的表达而影响戊糖磷酸途径和糖酵解,从而参与AML耐药。本研究使用生物信息学方法分析PD-L1的潜在靶点, 结果发现, PD-L1与G6PD存在互补位点,且双荧光素酶报告基因实验表明,G6PD是PD-L1的直接靶标基因,提示PD-L1可能经PPP途径调控G6PD表达而参与AML耐药过程。
本研究仍存在以下不足:1)并未进一步阐明PD-L1与G6PD在儿童AMI中的具体机制;2)未分析PD-L1除参与DNR耐药外与其他药物耐药的关系,因此,还需后续进一步深入研究。
综上所述,PD-L1在儿童AML中高表达,与患儿化疗耐药有关,其可能经过调控G6PD引起DNR耐药。
图8 PD-L1与G6PD之间相关性
参考文献:
[4]中华医学会儿科学分会血液学组,《中华儿科杂志》编辑委员会.儿童急性髓细胞白血病诊疗建议[J].中华儿科杂志,2006,44:877-878.
[5]王平,熊昊,李建新,等.CCLG-AML-2015方案治疗儿童急性髓系白血病的临床分析[J].中国实验血液学杂志,2022,30:373-380.
[6]孙林,周旭,章体玲,等.骨髓单个核细胞的提取、分离、标记和体外培养[J].中国心血管病研究杂志,2008,6:777-779.
基金资助:2021年度河南省科技攻关计划项目(212102310036);
文章来源:宋丽丽,管玉洁,马平,等.急性髓系白血病患儿柔红霉素耐药与PD-L1蛋白表达相关[J].基础医学与临床,2024,44(06):833-839.
分享:
t(16;21)(q24;q22)是一种罕见的白血病染色体异常,位于16号染色短臂2区4带上的髓系易位基因(myeloid translocation gene, MTG16)与21号染色体短臂2区2带上的急性髓系白血病1基因(acute myeloid leukemia 1,AML1)发生融合,该融合基因参与诱导白血病的发生[2]。
2024-09-02白血病患儿(0~17岁)是其中的一个特殊群体[3]。白血病是儿童和青少年常见的癌症之一,根据世界卫生组织的数据,全球每年约有35万人被诊断出患有白血病,其中儿童和青少年占到了20%左右。随着医疗和护理技术的发展,白血病患儿的幸存率逐年提高[4]。
2024-08-26急性髓系白血病(Acute myelogenous leukemia, AML)为白血病主要类型之一,成人发病率较高且治疗效果较差,对患者生命造成较大威胁。AML占儿童急性白血病的15%~20%,但却占因白血病患儿死亡人数的50%以上,其发病机制不明,且具有高侵袭及高转移的特点,严重影响患者预后,因此了解发病机制及寻找新的治疗方法对于改善患儿生存具有重要意义。
2024-08-22研究发现,中性粒细胞与淋巴细胞比值(NLR)、淋巴细胞与单核细胞比值(LMR)及肾母细胞瘤基因1(WT1)基因表达与AML存在一定的关系,但在儿童AML患者中研究仍较少,本文通过研究上述指标NLR、LMR及WT1基因在AML患儿中的表达情况及诊断价值,旨在为此类患儿的精准诊断进一步提供临床依据[4]。
2024-08-19混合表型急性白血病(mixed-phenotype acute leukemia,MPAL)是急性白血病中淋系和髓系同时受累的一种罕见疾病,根据白血病细胞的来源及抗原表达的不同可将其分为双表型、双系列和系列转换型三种,通过免疫学及细胞遗传学结果可对其诊断。一些研究表明,MPAL的预后较差,对于MPAL目前还没有统一的治疗方法[1-2]。
2024-08-13流行病学指出,国内白血病发病率为3/10万~5/10万,且呈逐年递增态势[1-2]。白血病在儿童恶性肿瘤致死中居首位,属于血液系统恶性病变,对儿童身体健康乃至生命安全造成严重威胁[3]。随着近些年医疗技术不断成熟,白血病患儿治愈人数日益增加,生存率明显提高。
2024-08-12急性淋巴细胞白血病(ALL)是急性白血病的一种类型,年发病率为3/10万~5/10万,主要起源于B系或T系淋巴祖细胞,白血病细胞在骨髓内异常增生和聚集并抑制正常造血,导致贫血、血小板减少和中性粒细胞减少;白血病细胞也可侵犯骨髓外组织,如脑膜、性腺、胸腺、肝、脾、淋巴结、骨组织等,引起相应病变。
2024-07-31白血病为造血干细胞的恶性克隆性疾病。该病在临床具有较高的发生率,其发生与免疫功能异常紧密相关[1-2]。近年来随着城市发展、人们生活习惯转变,白血病发生率呈逐年上升趋势。临床为控制患者病情的进一步恶化,通常选用化疗治疗白血病[3-4]。
2024-07-30急性髓系白血病(AML)是一种骨髓造血干/祖细胞恶性肿瘤,以骨髓和外周血中原始细胞的异常增殖为特征,是成人急性白血病中最常见的类型。虽然临床上强化化疗和同种异体造血干细胞移植取得了较大的进展,但由于疾病的难治性、复发性和耐药性等特点,导致大多数AML患者的预后仍较差,其5年生存率仅约为24%。
2024-07-29高白细胞急性白血病(hyperleukocytic acute leukemia, HAL)患者由于过多的白血病细胞在心、脑和肺等器官瘀滞,导致患者早期死亡率高达30%-54%。白血病细胞在肺内瘀滞引起的呼吸困难是白细胞瘀滞的最常见症状,严重者可发生急性呼吸窘迫综合征,需要呼吸机辅助通气,即使入住ICU并予机械通气后仍预后极差。
2024-07-29人气:19613
人气:17521
人气:14989
人气:14469
人气:14183
我要评论
期刊名称:白血病•淋巴瘤
期刊人气:1505
主管单位:国家卫生健康委员会
主办单位:中华医学会,山西省肿瘤研究所,陕西省肿瘤医院
出版地方:山西
专业分类:医学
国际刊号:1009-9921
国内刊号:11-5356/R
邮发代号:22-107
创刊时间:1992年
发行周期:月刊
期刊开本:大16开
见刊时间:7-9个月
影响因子:1.474
影响因子:2.876
影响因子:0.899
影响因子:0.000
影响因子:2.153
400-069-1609
您的论文已提交,我们会尽快联系您,请耐心等待!
你的密码已发送到您的邮箱,请查看!