长期以来，动物试验一直是包括疫苗在内的生物制品检验放行的重要组成部分。动物试验可提供关于潜在毒性、作用机制、药代动力学、生理分布和效力的重要信息。早期动物试验作为确保生物制品生产安全性和一致性的检测手段，被WHO技术指南及各国药典广泛采用。但近年来，随着疫苗研发、生产及质控水平的提高和产业升级，通过检验采用动物法作为每批产品放行的安全性指标，人们对动物试验的检测意义、要求、方式、操作等均提出了质疑。

本文结合我国生物制品监管现状，着重综述了动物替代（Replacement）、减少（Reduction）和优化（Refinement）（简称3Rs）原则在多个国家监管体系中的应用现状，以及近年来世界卫生组织（World Health Organization,WHO）全球相关专家对WHO生物制品指导原则中使用动物开展实验的梳理情况，旨在推进生物制品质量控制和批放行检测中3Rs原则的实施，为推动采用具有同等或更优的体外免疫学方法提供依据，有助于更好运用3Rs原则，以期为我国监管机构、制药行业修订相关内容提供参考。

1、3Rs概念

3Rs原则中，“替代”指避免或替代使用动物的方法；“减少”指尽量减少动物的使用以达到相同的实验目的，或使用相同数量的动物获得更多信息的方法；“优化”指采用减少实验动物痛苦的方法，提高实验动物福利。早在19世纪30年代即提出3Rs的概念[1]，至20世纪80年代早期，当越来越多的技术可以取代动物试验，3Rs也越来越受到重视。目前，3Rs原则正越来越多地应用于支持更人道的，对科学上更有力的动物研究，并作为在整个生物科学中许多研究和检测领域所采用的检测方法的科学依据[2]。

2、动物试验的局限性

据统计，全球每年有超过1 000万只动物被用于动物试验[3]。大量动物被广泛用于疫苗、细胞因子、酶和激素等药物开发、生产和质量控制，给制造商和国家质控实验室带来巨大经济负担的同时，也给动物带来痛苦，而且物种间存在的差异、动物法检测的固有变异性导致的不同批次产品间的一致性等问题，均使动物试验的安全性和有效性受到质疑[4]。

从科学角度看，一方面物种间差异是显而易见的；另一方面体内试验作为质量控制的检测方法，设定限值难以统一、给药体积及给药剂量不合理、结果易受干扰且缺乏明确的判定标准等试验原理及设计上的缺陷，导致试验结果参考价值受限。随着技术和生产条件显著提升，国际监管机构逐渐形成共识：严格的生产控制措施和有效的质量检测手段是保证产品安全有效的重要因素。由于体外免疫学方法变异少，易推广，目前用以替代生物制品的质量控制和批放行检验的一些方案已被监管机构引入和认可[5]。如单核细胞活化试验替代家兔热原试验，以及监测残留百日咳毒素作为替代小鼠组胺敏化试验的CHO细胞聚类试验，现已纳入《欧洲药典》7.0版[5-6]。

从全球监管角度来看，由于各国家对同一生物制品的安全性、有效性或效力检测的放行标准存在差异，且对同一动物的试验方案在不同区域间也存在差异，如动物品系、住房条件、时间、对照或参考文献等均会直接影响检测结果，并影响质量标准的制定。由于同一种产品可能在几十个国家注册，导致了重复的动物试验。且动物饲养成本高，检测周期长，是一种昂贵、耗时和人力资源密集型的检测方法，且体内反应的高变异性增加了检测结果的不稳定性，合理稳妥的替代方法的研究十分必要[7]。

对于多数疫苗的质量控制，开发物理化学或生物化学的分析方法可作为更有效的质量监测手段。越来越多的体外免疫学方法被证实比现有动物模型更科学，精确，可重复，更适用于疫苗批放行。以异常毒性检测为例，该项检测是针对外源性毒性污染物的通用安全性检测项，曾在世界范围内被各国药典收载。但随着《药品生产质量管理规范》（简称GMP）的实施，在药品生产过程中的污染或交叉污染已经得到有效控制，最大限度地避免或降低了差错的发生，使得异常毒性检测与药品质量、安全性之间的关联性受到质疑。WHO生物标准化专家委员会（Expert Commitee on Biological Standardization,ECBS）年度会议上，讨论通过了在常规批放行检验中停止使用异常毒性检测。

3、WHO生物制品指导原则相关替代草案

目前欧盟、英国、美国均有专门的国家实验室大力推动3Rs原则应用于动物试验各个方面。加拿大、澳大利亚、韩国是通过立法来实施3Rs。日本依赖于各动物机构内的自我监管，通过提供管理指导和自愿准则来鼓励灵活的动物研究。

2021年，WHO和英国国家改进、减少和优化动物研究中心（UK National Center for Improving,Reducing,and Optimizing Animal Research,UK NC3Rs）建立了新的合作伙伴关系，以审查WHO生物制品指导原则中进行了多少动物试验，以及这些动物试验是否可以替代、在制定指导原则中如何执行3Rs原则等[8]。其目的是使疫苗制造商和各国监管机构在有充分科学依据的情况减少动物试验，应用最新的非动物检测方法和策略，以改进生物制品质量控制和批放行检验中3Rs原则的实施，促进体外免疫学方法的统一采用，优化实验设计以及动物福利高标准化。用以支持全球疫苗更快、更低成本地投入市场，为减轻各国家或监管区域的监管负担提供了良好的契机，也是全球实现监管趋同的重要一步[9]。

2022年4月4—8日，WHO ECBS第75届会议以网络会议方式召开。UK NC3Rs的Elliot Lilley博士报告了对WHO生物制品规程中有关动物试验的梳理情况。截止会前已审查了81条指导原则，其中包含350项用于放行检测的动物试验。审查中根据不同的检测目的将动物试验划分为5个类别，每个小组对81份文件中的动物试验进行评估、汇总并提出相应的替代方案。5个类别分别为：外源性检查、神经毒力检测、热原性/内毒素检测、效力检测/免疫原性检测、特异性毒性检查[10]。

3.1针对外源性检查的建议草案

作为生物制品生产原料（生产基质）的安全性与终产品的安全性密切相关，而外源因子污染是影响生产基质安全性的一个极其重要的因素，生物制品生产基质及终产品中外源因子污染情况的监控是生产企业及各国药品管理机构最关注的问题。本文涉及的外源性检查包括分枝杆菌检查、红细胞吸附病毒检查、其他外源病毒检查及禽病毒检查。对于分枝杆菌检查，首先，要求经国家监管当局（National Regulatory Authority,NRA）批准，每个病毒种子批应使用培养方法（已知可灵敏检测出这些生物体）证明不含分枝杆菌。在完成适当的验证并获得NRA认可后，分子生物学技术可作为分枝杆菌微生物培养方法的替代方法。如果经过风险评估并获得了NRA批准，则不需对每批病毒收获物进行分枝杆菌检测；第二，针对红细胞吸附病毒检查，建议使用豚鼠或其他适合的哺乳动物红细胞，在观察期结束时，应对不少于25%的培养物进行检测，以确认是否存在红细胞吸附病毒。如果红细胞在用于吸附试验前已储存，储存时间不应超过7 d，储存温度应在2～8℃范围内；第三，基于风险评估，应制定病毒疫苗的外源病毒检测策略。相关的培养方法和/或特定的分子生物学或泛用的分子方法应作为整体检测组合的一部分，并获得NRA认可。考虑到整体检测组合，仅在风险评估证实可降低风险的情况下，才能使用体内检测；第四，对于禽病毒检查，在禽组织中培养的各病毒种子批或在原代禽组织中培养的各批病毒收获液均应进行禽病毒检测。相关的培养方法和/或NRA批准的分子生物学或泛用的分子方法应作为整体检测组合的一部分。只有风险评估表明动物试验（包括已受精的SPF卵）可降低风险的情况下，才可用于病毒种子批的符合性检验。在收获病毒的常规放行检验中不进行动物试验。

3.2针对神经毒性检测的建议草案

应在进入临床阶段前，对新疫苗选用的菌（毒）株开展潜在的神经毒性评估，并根据已获得的数据和信息进行风险评估。如果在此过程中已证实了遗传稳定性，则可省略病毒种子批和/或常规生产中神经毒性的检测。

对于目前规定需要开展动物神经毒性检测的产品，一旦产品安全性和遗传稳定性得到充分验证则可取消这项检测。同时，通过已获得的历史临床数据、药物警戒数据，以及通过核酸扩增和测序技术获得的数据来分析病毒的遗传稳定性，并建立基因序列和体内表型之间的关系。

对于所有产品，应基于风险来考虑菌（毒）株的遗传特征和遗传稳定性（通过对传统或新的测序技术确定的不同阶段的序列进行评估）以及疫苗的类型（减毒、联合、转基因），评估是否需要进行神经毒力检测，以及哪种动物模型最适合。如需开展体内试验，应确定在哪个生产阶段（主种子批、工作种子批等）进行检测，以避免不必要的重复。

3.3针对热原和内毒素检测的建议草案

总的原则是，终产品中的内毒素含量检测应使用合适的体外法。如采用重组因子C(recombinant factor C,r FC）和鲎变形细胞裂解物（limulus amoebocyte lysate,LAL）测试。因LAL测试可对鲎种群产生持续性影响，强烈建议采用r FC法。内毒素含量的检验标准应与临床试验中使用的终产品批次一致，并在NRA规定限度内。

对于热原检查，在产品开发期间进行评估是必要的，且在生产过程中发生任何重大变化或可能对热原检测结果产生影响，则要进行重新评估。在产品完成全面验证后，则可以采用单核细胞活化测试（monocyte activation test,MAT）法用于热原检查。兔热源检查法由于其固有的变异性、重新测试率高以及与人类的种间差异，应最大程度的避免使用。

3.4针对疫苗效力检测的建议草案

3.4.1针对所有疫苗效力的通用原则

建议草案中明确指出，虽然目前动物模型被广泛应用于疫苗效力检测，但没有一种动物模型可与临床保护力的血清学和免疫学直接相关。提倡采用经过验证的物理化学、生物学或生化分析等方法监测疫苗生产一致性及疫苗质量。体外免疫学方法操作的便利性、检测结果的准确性和重复性高等特点更适合疫苗的批签发。如需进行体内测试，应采用基于风险分析的方法明确在哪个生产阶段（半成品或成品）进行测试，不应在2个生产阶段均开展体内检测。

3.4.2针对体内效力试验的建议草案

建议草案中，按照疫苗类型及效力试验检测方法共分为3类：第一类，动物攻毒保护监测；第二类，免疫后抗体检测；第三类，不属于上述检测类型的未明确检测类型的其他类。

针对第一类需进行动物攻毒试验的产品，如蛇毒血清、狂犬病疫苗、蜱传脑炎病毒疫苗、出血热疫苗、无细胞百白破疫苗均需开展效力检测。一直以来采用的动物试验引起了伦理思考，鼓励验证采用可替代动物试验的免疫化学方法，尽可能应用适当的镇痛、麻醉、人道终点、高标准的动物饲养和护理以及优化实验设计，并以最少数量的实验动物进行检测。草案中特别提到了全细胞百日咳疫苗，由于已开发的生物学检测方法比Kendrick试验更敏感和可重复，如获得NRA批准，则应使用生物学检测方法。如果生物学检测是首选，必须进行Kendrick检测，则应有科学依据，并获得NRA批准。

针对第二类免疫后进行抗体检测的疫苗，又分为以下3类：(1)应用血清学检测+体外抗体检测测定疫苗效力的疫苗类型：白喉疫苗、无细胞百日咳疫苗、破伤风疫苗、无细胞百白破疫苗、疟疾疫苗、日本脑炎疫苗、肠道病毒71型疫苗、乙型肝炎病毒疫苗、脊髓灰质炎灭活疫苗、戊型肝炎病毒疫苗、人乳头瘤病毒疫苗体外抗体滴度的生物学检测。如获得NRA批准，可被认为是适合作为效力检测的方法[如采用取决于检测成分的体外试验：破伤风抗毒素小鼠中和试验（tetanus antitoxin neutralization test,TNT）、酶联免疫吸附试验（enzyme linked immunosorbent assay,ELISA/ELASA）、移动抑制试验（migration inhibition test,MIT）]。在一些国家，已经使用多重免疫测定法（multi-residue immunoassay,MIA）对DTa P联合疫苗进行抗体滴度检测；(2)应用血清学检测+体内抗体检测测定疫苗效力的疫苗类型：白喉疫苗、无细胞百日咳疫苗、破伤风疫苗、无细胞百白破疫苗。在获得NRA批准后，依据检测的成分，可应用体外抗体滴度的生物学检测（包括体外TNT、ELISA、MIT试验）替代体内抗体滴度检测。在一些国家，已经使用MIA检测DTa P联合疫苗的抗体滴度；(3)应用血清学试验+未明确的抗体检测疫苗效力的疫苗类型：合成肽类的疫苗、裂谷热疫苗、肠道病毒71疫苗。针对上述疫苗，在获得NRA批准后，已被证实可作为效力试验的体外检测方法（如ELISA试验），可用于疫苗成品批的放行检测，且体外效力检测是首选。

针对第三类未明确病毒类型的体内效力试验：呼吸道合胞病毒疫苗、甲型肝炎病毒疫苗，针对已确认并获得批准的合适的体外检测方法（如ELISA试验）被认为适合作为效力检测，则应作为首选。采用适合的特异性抗体或其他亲和结合剂的定量体外效力检测方法对每个半成品或成品批次进行检测。如果1个半成品批次被用于多个成品批次，则应对半成品批次进行体内检测，而在成品批次上豁免检验，以减少动物使用。在对半成品进行足够数量的生物学检测并证明了生产的一致性后，则应实施NRA批准的单一稀释度检测[11]。

3.5针对毒性测试的建议草案

毒性测试特殊性质决定了需要更长的时间进行验证。目前正在进行的体内毒性检测包括：针对卡介苗疫苗质量、安全性和有效性的结核菌素试验，或者是结核菌素皮内试验（purified protein derivative,PPD），白喉疫苗（吸附）特异性毒性试验，肾综合征出血热（hemorrhagic fever with renal syndrome,HFRS）疫苗（灭活）每批次的病毒灭活验证，均应尽可能通过NRA批准的体外方法进行测试。如果体外试验不可用或不合适，可使用合适的药典体内试验方法，如Vero细胞检测白喉毒素具有高度敏感性，被认为优于现有的体内检测。

4、中国目前的监管及执行现状

我国监管部门不断完善了监管制度框架，提高了监管水平，陆续出台了多部法规和条例，明确规定实验动物的使用应遵循3Rs原则。

2003年，国家药品监督管理局（National Medical Products Administration,NMPA，原国家食品药品监督管理局）颁布了药物非临床研究质量管理规范（Good Laboratory Practice,GLP）法规。2018年9月，国家质量监督检验检疫总局（General Administration of Quality Supervision,Inspection and Quarantine of the People′s Republic of China,AQSIQ）与国家标准局联合颁布实验动物——福利伦理审查指南，规定了实验室动物生产、运输和使用过程中的伦理审查和动物福利管理的要求，涵盖审查机构、审查原则、审查内容、审查程序、审查规则和档案管理。还明确了3Rs的概念，并在第5章“审查原则”中规定[12]：对确有必要进行的项目，应遵守3Rs原则，对实验动物给予人道保护。在不影响项目实验结果科学有效性的情况下，尽可能采取替代方法，减少不必要的动物数量，降低有害使用动物的频率和危害程度。

2021年8月，我国发布了最新版中华人民共和国实验动物管理条例（修订草案征求意见稿）。

随着监管形势的不断变化，我国对生物制品尤其是疫苗的放行检验中，开展动物试验的必要性越来越引起关注，针对不同疫苗质量特性、疫苗免疫机制开展充分研究，在明确检测目的、检测适用性、替代方法可行性等影响产品质量的风险可控下，鼓励替代方法的开发。我国已建立了多个快速、简便的免疫学及理化定量的效价检测方法，对仍需依赖动物和细胞的经典方法，也从减少动物和改进检测方法等方面进行了调整。目前狂犬病疫苗的批签发已纳入一步稀释法，大大减少了动物的使用。但在替代方法的研究过程中也不断发现一些新的问题并出现瓶颈[13]。如我国乙脑灭活疫苗效力检测采用小鼠体内评价方法[14]，疫苗免疫小鼠后，经采血、分离血清，利用蚀斑减少中和试验测定抗体效价，ELISA试验检测疫苗中抗原含量。研究发现，此方法可反映疫苗中抗原量高低，但不能反映有效抗原含量高低，如热稳定性评价的疫苗（37℃放置2周），体内效力虽明显降低，但体外方法检测到的抗原量未见明显减少。因此目前该方法依然存在缺陷，仅可初步用于初筛疫苗中的抗原含量[15]。如我们开展了狂犬病疫苗糖抗原测定方法的研究[16]，与国外上市疫苗不同[17]，我国狂犬病疫苗各生产企业选择的毒株不同，造成糖蛋白的结构也不完全相同，进行中和抗体检测（ELISA试验）时发现，虽然每一种糖蛋白与保护力存在相关性，但不同毒株和不同工艺生产的糖蛋白，其保护力水平不同，糖蛋白含量高的，效价反而低，包被抗原的亲和力存在较大差异，其不同企业间的效价限值也不同，很难用统一标准进行放行[13]。但国际贸易的全球化，不断进行替代方法的完善和研究是必然趋势，为配合趋同的全球药品质量标准的出台，监管机构应联合各疫苗生产企业对具体问题进行具体分析，结合不同疫苗产品特点，针对性地充分开展自身疫苗产品的检测方法研究，并进行充分验证。对新研发上市的品种，应尽早开展体外效力方法的研究和替代工作。如我国新上市的EV71疫苗，在研发阶段即采用体内和体外两种方法进行效价研究，通过积累数据和相关性分析，体外效力指标可有效用于疫苗的质量控制，为方法的替代奠定了坚实的基础。

5、小结

随着疫苗研发、生产及质控水平的提高，越来越多的物理化学或生物化学分析方法被用于疫苗质量监测。研制并建立快速、简便的替代方法，是提升疫苗质控和监管能力的有效途径。替代方法建立的基础是疫苗生物活性成分含量与免疫效果呈相关性，对于相关性不佳的疫苗，如白喉疫苗等，仍需依赖动物和细胞的经典方法，也应从减少动物或改进检测方法等方面进行改良。在确保不影响疫苗质量和安全的前提下，鼓励疫苗生产企业主动研究，加快建立简便快速的疫苗效价检测方法，为我国监管机构、制药行业修订相关内容提供参考，满足疫苗生产供应及监管的需要。

基金资助:中国医学科学院医学与健康科技创新工程项目资助(2021-I2M-5-005);

文章来源:唐静,张洁,徐苗.3Rs原则在生物制品质量控制中的应用现状及对策分析[J].中国生物制品学杂志,2024,37(08):1020-1024.