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马里苷减轻高糖诱导的大鼠心肌细胞系H9c2损伤

2024-09-03 6 上传者：管理员

摘要：目的研究马里苷对高糖所致大鼠心肌细胞系(H9c2)损伤的影响。方法将H9c2细胞分为对照组(Ctrl)、高糖(30 mmol/L)损伤模型组和马里苷(25、50、100μmol/L)干预模型组。MTT法检测H9c2细胞的活性；Western blot检测细胞LC-3Ⅱ/Ⅰ、p62、mTOR蛋白表达。结果与对照组相比，模型组细胞活性下降(P<0.01),马里苷组H9c2细胞活性显著增强(P<0.01);模型组LC-3Ⅱ/Ⅰ蛋白表达水平降低(P<0.05),p62及mTOR水平升高(P<0.01),马里苷组LC-3Ⅱ/Ⅰ水平增加，p62及mTOR降低(P<0.01),且随着浓度的增加蛋白质表达量更加明显。结论马里苷能够影响高糖诱导的心肌细胞损伤的自噬相关蛋白质的表达。

关键词：
DCM
H9C2细胞
自噬
马里苷
高糖损伤
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糖尿病性心肌病(diabetic cardiomyopathy, DCM)是独立于冠心病、高血压等心血管疾病的一种特异性心肌病。是2型糖尿病常见并发症之一。目前研究表明，糖尿病心肌病会在长期高血糖、能量代谢异常等的影响下，导致心肌代谢紊乱，心肌间质纤维化，心肌细胞凋亡，心室重构等一系列病理生理反应。最终导致患者出现心脏功能的衰竭。

用于治疗糖尿病性心肌病的药物目前主要包括他丁类[1]、胰高血糖素样肽-1(glucagon-like peptide-1,GLP-1)[2]、双胍类、α-糖苷酶抑制剂、胰岛素增敏剂等[3]。上述药物虽然可显著降低血糖，但它们并未有效抑制或改善糖尿病性心肌病的发生及演变过程，临床研究对于糖尿病心肌病的发生机制仍不明确，同时也无特异性的诊治方法[1,4-5]。从传统的民族药中寻找新型的药效稳定和安全的治疗药物成为一个新的方向。

马里苷(marein)是一种从两色金鸡菊头状花序中分离得到的黄酮类单体化合物[4]。研究表明，马里苷对血糖调节有一定的影响，能够改善高胰岛素抵抗，清除自由基活性[5-6]、并且能够增强糖尿病肾病肾脏组织的自噬水平[7],但马里苷对糖尿病性心肌病的作用尚不清楚。本研究通过马里苷干预高糖所致H9c2细胞损伤体外模型，观察其对细胞活性及自噬相关蛋白的影响，研究马里苷对高糖所致大鼠心肌细胞系损伤的影响。

1、材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞系：

大鼠心肌细胞系H9c2(上海中乔新舟生物科技有限公司)。

1.1.2 主要试剂：

马里苷(marein; Extrasynthese公司；纯度99.9%);胎牛血清(Gibco公司);基因引物序列(上海生工生物合成);二甲双胍(metformin, Met)(MCE公司);辣根过氧化物酶标记山羊抗体(博奥森生物技术有限公司);兔抗P62、LC3-Ⅱ/Ⅰ、m-TOR抗体(Cell Signaling Technology 公司);兔抗GAPDH抗体(Affinity生物科学公司);蛋白质marker(10～180 ku)、BCA蛋白质定量试剂(Thermo Fisher Scientific 公司)。

1.2 方法

1.2.1 细胞的分组及处理：

将H9c2细胞分为对照组(Ctrl)、高糖损伤模型组(model, 30 mmol/L 葡萄糖作用24 h)、阳性药对照组(Met, 1 mmol/L),分别用马里苷低浓度(25 μmol/L)、中浓度(50 μmol/L)、高浓度(100 μmol/L)干预模型组，每组n=3。将细胞放于37 ℃、5% CO2的培养箱中用完全培养基培养，定期观察细胞状态。取对数生长期细胞，细胞计数后按1×105个心肌细胞种于96孔板中，加细胞悬液按100 μL/孔。次日观察细胞，待细胞增殖至80%～90%汇合后换液并确定高糖浓度分组，每孔加入200 μL浓度不同的葡萄糖溶液(20、30、40、50 mmol/L),分别处理24 h和48 h后弃上清。每孔加20 μL的5 g/L MTT,室温避光孵育4 h后弃上清。每孔加150 μL的二甲基亚砜(DMSO),用全自动酶标仪在波长490 nm下测定各孔的吸光度(A)值，A值越大表明细胞存活的越多。对照组以等量含有10%的完全低糖培养基处理24 h和48 h。细胞存活率(%)=实验组平均A值/对照组平均A值×100%。

1.2.2 MTT法检测H9c2细胞活性：

将对数期的H9c2细胞以细胞密度为1×105个接种于96孔板上，加入不同浓度的马里苷溶液(25、50、100、200、400、800、1 000 μmol/L)处理24 h和48 h, 检测马里苷对细胞毒性。对照组以等量含有10%的完全低糖培养基处理24 h和48 h。

1.2.3 Western blot检测P62、LC3-Ⅱ/Ⅰ、mTOR蛋白的表达：

待细胞增殖至80%～90%汇合度后，按1×105个细胞接种于6孔板中，药物干预48 h后，加入含有1%磷酸酶抑制剂混合物的细胞高效蛋白裂解液200 μL,收集上清液，置冰上短暂存放或放置-80 ℃冰箱长期保存。取出-80 ℃冰箱保存的心肌细胞提取蛋白质，加入组织高效蛋白裂解液后在冰上放置30 min, 匀浆、裂解并离心，取上清液弃沉淀，并将其放在冰上进行短期保存或放在-80 ℃的冰箱中进行长期保存。用BCA法进行蛋白质定量后进行SDS-PAGE,转PVDF膜，浸入配置好的5%牛奶的封闭液中于摇床上封闭1.5 h。用1×TBST清洗3次，每次10 min。4 ℃冰箱敷一抗过夜。次日，用1×TBST冲洗3次，每次10 min。敷二抗，室温避光摇床孵育1.5 h。1×TBST洗膜3次，每次10 min。加加强型化学发光液(enhanced chemiluminescence, ECL)试剂，曝光显影成像。利用ImageJ软件对数据进行分析。

1.3 统计学分析

数据采用SPSS 21.0统计软件进行分析处理，测定结果均采用均数±标准差

表示，组间比较采用单因素方差分析(One-way Anova)。

2、结果

2.1 马里苷对H9c2细胞活性的影响

与对照组比较，模型组H9c2细胞活性显著降低(P<0.01);马里苷组的细胞活性显著回升(P<0.01)(图1)。

2.2 马里苷对H9c2细胞p62和LC3-Ⅱ/Ⅰ蛋白表达的影响

与对照组比较，模型组H9c2细胞p62蛋白表达水平显著升高(P<0.01),LC3-Ⅱ/Ⅰ表达水平显著降低(P<0.05);与模型组相比较，马里苷组p62表达水平回降，马里苷浓度为100 μmol/L蛋白表达水平显著降低(P<0.01)。LC3-Ⅱ/Ⅰ表达水平回升，且马里苷浓度为50、100 μmol/L时效果更显著(P<0.01)(图2)。

图1 马里苷对H9c2细胞活性回升

图2 马里苷对H9c2细胞p62和LC3-Ⅱ/Ⅰ表达的影响

2.3 马里苷对H9c2细胞mTOR表达的影响

与对照组比较，模型组H9c2细胞mTOR蛋白表达水平显著升高(P<0.01),与模型组相比较，马里苷组H9c2细胞mTOR表达水平回降，随着马里苷浓度的增加，蛋白表达水平更显著性降低，当马里苷浓度为50、100 μmol/L时，效果更明显(图3)。

图3 马里苷对H9c2细胞mTOR表达的影响

3、讨论

H9c2细胞的表型类似心脏细胞，其能量代谢与正常原代心肌细胞相似，因此被广泛应用于分析胰岛素抵抗和缺血心脏的预处理损伤。为研究心肌细胞损伤，该细胞系为较合适的模型[8]。本实验建立高糖诱导H9c2细胞体外损伤模型，旨在探究不同剂量的马里苷对细胞活性的影响。根据实验结果表明，马里苷对高糖诱导的H9c2细胞表现出保护作用，随着马里苷剂量的增加，细胞增殖率逐渐上升，细胞活性明显增强。和对照组相比，马里苷组能够增强自噬相关蛋白LC-3Ⅱ/Ⅰ的表达，降低p62及mTOR的水平，且随着马里苷浓度的增加蛋白表达量发生明显改变，说明马里苷能够影响高糖诱导的心肌细胞损伤的自噬相关蛋白的表达。

自噬是一种细胞自我保护过程的机制，它通过溶酶体降解途径分解异常蛋白质和受损的细胞器，从而维持细胞的稳态[9]。高糖可以导致H9c2细胞毒性的增加，细胞的凋亡和细胞自噬的被抑制[10]。本实验研究发现，高糖可升高自噬相关蛋白p62与mTOR 的表达水平，降低LC3Ⅱ/Ⅰ 的表达，而马里苷能够改善高糖引起的自噬水平降低。

心肌细胞在很大程度上也需要自噬来清除异常和受损的蛋白质和细胞器，以维持心肌的正常运作。自噬是一种进化上保守的周转过程，在分解长寿蛋白、处理聚集蛋白或维修功能障碍的细胞器时发挥着重要作用，同时还能产生能量和大分子前体。LC3是一种可溶性蛋白，广泛存在于哺乳动物组织和多种培养的细胞中，是自噬的关键调节因子，它是通过与ATG7和其他自噬效应因子的相互作用而被膜结合后，启动自噬的发生[11]。LC3-Ⅰ转移到LC3-Ⅱ是自噬启动的标志，在高糖时抑制LC3的转换，抑制自噬[12]。此外，p62缺失会导致LC3-Ⅱ的形成受损。另一方面，沉默p62也可以激活自噬，这可以通过LC3I向LC3II的转化率以及自噬体的数量增加来证明。

在细胞自噬的调控中，mTOR激酶扮演着重要角色，激活的mTOR可以抑制自噬过程，而mTOR的负调节作用则促进自噬。在自噬的诱导过程和终止中mTOR起着重要的作用。在自噬途径中期mTOR信号通路起到负调控作用，引起心肌细胞的损伤。研究表明马里苷下调mTOR,其保护作用可能与调控自噬有关，具体机制有待进一步研究。

参考文献:

[6]崔桂丽.自噬在高糖高脂对 H9c2 心肌细胞凋亡中的影响[D].山西医科大学,2017:33-38.

基金资助:新疆维吾尔自治区高校科研计划(XJEDU2020Y021);国家级大学生创新创业训练计划(202010760011);新疆医科大学博士启动基金(2023);

文章来源:祖力皮亚·阿布拉,赵强,张泰民,等.马里苷减轻高糖诱导的大鼠心肌细胞系H9c2损伤[J].基础医学与临床,2024,44(09):1269-1273.