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喹乙醇对体外卵母细胞及胚胎发育的影响

2024-09-09 21 上传者：管理员

摘要：喹乙醇(Olaquindox, OLA)作为有效的抗菌药剂，广泛应用于畜禽养殖业.然而，喹乙醇是否对体外卵母细胞及胚胎发育有影响尚不清楚.本实验采用不同浓度喹乙醇(0.1 mM,0.5 mM,1.0 mM,2.0 mM,5.0 mM)对体外获取生发泡(Germinal vesicle, GV)期卵母细胞体外培养，观察卵母细胞的体外成熟率.其次，对实验组体外成熟卵母细胞进行激活发育，统计卵细胞激活率.最后，使用喹乙醇处理体外受精卵观察胚胎发育情况，观察胚胎各阶段发育率并通过荧光定量PCR囊胚期OCT4(Octamer-binding transcription factor 4,OCT4)、CDX2(Caudal type homeobox 2,CDX2)基因表达水平.实验结果显示，1.0 mM、2.0 mM、5.0 mM OLA处理GV期卵母细胞显著阻碍卵母细胞成熟(P<0.05);5.0 mM处理下卵母细胞激活率显著降低(P<0.01).同时，高剂量的喹乙醇处理下，早期胚胎囊胚发育受阻，相关发育基因OCT4、CDX2 mRNA表达水平呈显著下降.

关键词：
卵母细胞发育
喹乙醇
胚胎发育
胚胎质量
邻硝基苯胺
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喹乙醇(Olaquindox, OLA),又名倍育诺，属于喹噁啉类[1].它是以邻硝基苯胺为化学原料合成一种具有广谱性抗菌类药物，其对动物肠道内致病性大肠杆菌、沙门氏菌等具有良好的抑制及杀灭效果，同时又增强饲料转化率，减少动物疾病发生[2].长久以来，喹乙醇被认为低毒有效抗菌类药品，广泛用于畜禽养殖业、渔业及动物皮毛养殖上.但近年来，研究者已证实长期大剂量使用喹乙醇药物出现药物及代谢产物蓄积引起的中毒反应，严重损害肝脏、肾脏等实质性组织器官[3-5 ].近年来的研究显示，喹乙醇药物残留导致中国仓鼠肺成纤维细胞(Chinese hamster fibroblast cell line, CHL)染色单体断裂和交换的遗传性生殖中毒，引起人们广泛关注[6].同时，Zhao等研究发现高剂量喹乙醇致使人肝癌细胞(Human hepatocellular carcinomas, HepG2)细胞内线粒体受到氧化性损伤，反应活性氧类的含量呈剂量依赖性的增加[7].

动物繁殖能力高低制约现代农业发展，获取大量且高质量的卵母细胞及胚胎成为现代繁殖的关键技术.然而卵细胞及胚胎发育成熟是十分复杂的过程，其受到自身卵巢、代谢物质及外在环境影响[8,9].合成抗菌类有毒代谢物质的残留蓄积造成胚胎发育后期着床率低、流产率高、胎儿畸形高等繁殖问题[10].研究者使用喹噁啉类药物喹烯酮作为饲料添加剂投喂小鼠，结果显示高剂量喹烯酮药物引起子宫扩张、卵巢囊泡及睾丸萎缩等生殖器官病变现象[11 ].由于喹乙醇及代谢物质长期残留特性[12],目前喹乙醇及代谢物质对卵母细胞发育过程影响尚不明确.开展喹乙醇对卵母细胞胚胎发育研究，阐明喹乙醇抗菌类药物对动物繁殖的影响具有重要意义.本研究以常用饲料添加剂喹乙醇为受试物，研究其对小鼠体外卵母细胞成熟及胚胎发育的影响，以期为评价饲料中该类抗菌药物对动物生殖毒性提供基础实验数据和理论依据.

1、材料与方法

1.1实验动物饲喂管理

实验使用SPF级雌性3-6周龄和雄性10-12周龄的昆明白小鼠，采购于皖南医学院动物实验中心.所有实验小鼠按照SPF级动物饲养管理规范进行饲养管理.饲喂要求在光照12 h,温度(20±3)℃,环境湿度55%-65%控制条件下，整个实验研究期间自由采食及饮水.所有实验操作和动物处理参照国家相关指导条例进行.

1.2实验用化学药品及试剂

喹乙醇(纯度≥99.53 %,Sigma)、孕马血清促性腺激素PMSG(宁波三生)、牛血清白蛋白(Sigma)、卵细胞培养液M2(Sigma)、胚胎培养液M16(Sigma)、氨基酸胚胎培养液KSOM+AA(Sigma)、微量反转录试剂盒(Thermo)、透明质酸酶(Sigma)、石蜡油(Sigma)、精子获能液HTF(Sigma).

所有实验雌性小鼠腹腔注射10 IU PMSG,44 h后颈椎脱臼法处死，75%乙醇腹腔消毒，使用手术剪沿腹中线剪开腹膜，切开腹腔，暴露子宫.沿着子宫剪下卵巢，剔除多余的脂肪组织，用M2培养液反复清洗三次后置于无菌培养皿中.用无菌刀片充分切碎卵巢，加入M2培养液进行冲散.在体视显微镜下选取生发泡期(Germinal vesicle, GV)且质量较好的卵母细胞，分别置于含有0.1 mM、0.5 mM、1.0 mM、2.0 mM、5.0 mM OLA的M16胚胎培养液中.在37℃,5% CO2培养箱中培养3 h、14 h后收集统计，分别对应卵母细胞的生发泡破裂期(Germinal Vesicle Breakdown, GVBD)和第二次减数分裂中期(Metaphase II,MII) .

1.3实验方法

1.3.1 MII期卵母细胞激活处理

分别收集OLA处理14 h处于MII期卵母细胞，用胚胎培养液KSOM+AA清洗3-5次.将MII期的卵母细胞置于含有7%乙醇的KSOM+AA中，处理7 min后立即置于37℃、5% CO2培养箱中培养3 h观察卵母细胞是否成功激活，24 h后半量换液.

1.3.2 MII期成熟卵母细胞体外受精

将雄性10-12周龄的昆明白小鼠颈椎脱臼法处死，75%乙醇腹腔消毒，切开腹腔，暴露输精管位置.用手术剪刀及镊子分离附睾尾部，附睾尾剪断数段，将内容物挤出，置于1 mL过夜平衡的HTF精子获能液中，37℃、5% CO2培养箱中精子获能2-3 h.按1.2方法收集MII期成熟卵母细胞置于KSOM+AA胚胎培养小液滴中，吸取100μL获能精子移入胚胎培养液中，用石蜡油覆盖37℃、5% CO2培养箱中培养.精子浓度为(1.5-2)×106个/mL ,精卵共孵育6 h.

1.3.3体外受精胚胎的培养

卵母细胞与精子共孵育6 h后，将受精卵转移至含有氨基酸的胚胎培养液KSOM中，石蜡油覆盖，置于37℃、5% CO2培养箱中培养.受精后9-10 h出现卵细胞两个原核证实受精成功.受精卵在含有2.0 mM OLA的胚胎培养处理2 h后，植入KSOM+AA胚胎培养液中于18 h、48 h、72 h和96 h计数2细胞、4细胞、桑椹胚和囊胚期的发育率.

1.3.4荧光定量RT-PCR检测

获取囊胚期细胞，按照试剂制造商说明使用RNA微量试剂盒(QIAGEN RNeasy Plus Micro Kit, Cat#74034)从10枚胚胎细胞中提取mRNA,利用逆转录合成cDNA试剂盒(Thermo)将mRNA反转录成cDNA.RT-PCR扩增反应体系如下：cDNA 1μL、Forward Primer 0.5μL、Reverse Primer 0.5μL、SYBR Mix 5μL、ddH2O 3μL.预变性95℃,5 min.RT-PCR扩增反应为95℃,15 s、60℃,30 s、72℃,45 s, 44个循环.靶基因为OCT4、CDX2、GAPDH,内参基因为GAPDH,靶基因扩增的引物序列见表1.

表1 RT-PCR所用引物序列

1.4数据统计与分析

实验采用单因素方差分析，数据通过SPSS 17.0软件进行LSD多重比较显著性分析，使用GraphPad Prism软件作图.

2、结果与分析

2.1 OLA对小鼠卵母细胞发育的影响

为了研究喹乙醇对体外卵母细胞发育的影响，以卵母细胞的GVBD和MII成熟率为细胞发育的评定标准.实验使用不同浓度喹乙醇分离培养GV期卵母细胞.结果如图1所示，不同浓度OLA处理下体外卵母细胞生发泡破裂率无显著性差异(图1-a).与空白组相比，1.0 mM、2.0 mM OLA处理下体外卵母细胞MII期成熟率显著下降(P<0.05);高剂量组5.0 m MOLA处理下卵细胞成熟率显著降低且差异极显著(P<0.01)(图1-b).

图1不同浓度OLA处理下对体外卵母细胞发育影响

2.2 OLA对成熟卵母细胞激活的影响

为了进一步探讨喹乙醇对成熟卵母细胞发育的影响，实验利用7%乙醇将成熟的卵母细胞激活.实验中将具有雌性原核或细胞内出现碎片状的卵母细胞作为激活标准.实验在不同浓度喹乙醇暴露下发育成熟卵母细胞进行激活处理.研究表明(图2),喹乙醇在低剂量组(0.1 mM、0.5 mM、1.0 mM)处理下MII期卵母细胞激活率分别为84.5%、83.9%、82%.与对照组相比，卵母细胞激活率为85.3%无显著差异.然而在高剂量组2.0 mM和5.0 mM MII期卵母细胞激活率为70.2%、70.8%,与其它组相比差异显著(P<0.05).

图2不同浓度OLA处理下对卵母细胞激活的影响

图3小鼠囊胚期OCT4、CDX2基因的表达

2.3 OLA对体外胚胎发育潜能的影响

为了确定喹乙醇是否影响受精卵的质量，尤其是对随后的胚胎发育的潜能的影响.将实验分为两组：一组添加0 mM(对照)OLA,另一组添加2.0 mM(实验)OLA.如表2所示，实验组在2细胞、4细胞、桑葚胚和囊胚期的胚胎发育率分别为64.2%、51.9%、39.5%、19.8%.实验组在各阶段胚胎发育率低于对照组且差异极显著(P<0.01).这些数据表明，受精卵暴露在OLA下可能阻碍体外胚胎发育.

表2喹乙醇对小鼠体外胚胎发育的影响

2.4囊胚胚胎发育相关基因mRNA水平表达

发育相关多能基因如OCT4和CDX2在胚胎发育中发挥至关重要作用.为了阐明OLA对胚胎发育的影响，我们采用实时荧光定量PCR技术检测了这两个基因的mRNA表达水平.实验结果显示(图3),与对照组相比，2.0 mM处理组的囊胚中OCT4的表达显著性降低且差异极显著(P<0.01);囊胚中CDX2表达显著性降低(P<0.05).

3、讨论与结论

OLA作为一种有效的广谱抗菌素广泛应用于畜牧养殖业[13].然而，已有的研究证实过度使用抗生素引起动物抗菌素耐药性和毒性反应[ 14 ].虽然OLA在许多国家被有限制的作为饲料添加剂使用，但在畜牧业生产动物饲料添加剂中滥用OLA以及其他喹恶啉类仍然很严重.过度使用OLA因代谢产物及残留物引起动物肝脏、肾脏、卵巢、睾丸等器官产生实质损害.卵巢正常发育产生数量较多且高质量的卵母细胞是衡量动物繁殖力的主要因素.近期研究认为OLA加重了卵巢和卵母细胞的氧化应激，并通过影响GV期卵母细胞质量进而引起早期胚胎发育的毒性作用[ 15 ].我们研究发现在2.0 mM、5.0 mM高剂量OLA处理的体外GV期卵母细胞，MII期成熟卵母细胞百分比也有所下降，而且成熟卵母细胞激活率较低，这反映了核成熟过程受损.这一结果与Gao等人用60 mg/(kg·d)灌喂小鼠后卵巢内GV期和MII期卵母细胞数量减少相符合[ 15 ].同时，高剂量OLA诱导卵母细胞的DNA损伤和细胞氧化应激出现.Jia等人研究发现氧化应激引起的DNA损伤和细胞凋亡会导致卵母细胞质量和生育能力的下降[16].这表明OLA引起DNA损伤，导致卵发育相关基因调控受阻，进而导致卵细胞核成熟与细胞质成熟不足，这对后期胚胎发育产生负面影响.

哺乳动物早期胚胎发育受到发育相关基因严格调控，尤其OCT4、CDX2是调控其发育的关键基因[17,18].先前的研究发现，早期胚胎由精卵到囊胚后期的整个发育过程中，OCT4、CDX2基因组转录水平处于高位表达[ 19].其中OCT4能否正常表达是囊胚后期附植子宫的关键[20].我们研究发现，在高剂量组2.0 mM OLA处理下，囊胚期OCT4、CDX2基因mRNA水平均呈现显著下降趋势.

总之，研究发现OLA阻碍体外卵母细胞发育成熟.发育不成熟的细胞质造成卵细胞激活率下降，高剂量OLA引起早期胚胎生殖毒性，造成胚胎发育受阻.

参考文献:

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[9]柳淑芳,杜立新,王继英.哺乳动物卵母细胞发育机理的研究进展[J].黄牛杂志,2001,27(04):43-45.

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[11]刘倩莹.喹噁啉类遗传毒性和致癌性的研究[D].广州:华中农业大学,2020.

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[13]吴莉芳,张东鸣,黄权,等.喹乙醇饲料添加剂在养殖生产中的应用[J].中国禽业导刊,2000(08):23.

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基金资助:安徽省高校自然科学研究项目(2022AH052193);安徽省高校青年人才支持计划(gxyq2022203);安徽省教育厅自然科学项目(KJ2021A1323);芜湖职业技术学院2021年校级中青年骨干教师项目;芜湖职业技术学院2021年校级优秀拔尖人才项目;