首页 > 论文范文 > 医药卫生论文 > 药学论文 > 西药论文 > 抗体-IL-2耦联物纳米药物对多发性硬化的作用及机制

抗体-IL-2耦联物纳米药物对多发性硬化的作用及机制

2024-11-12 19 上传者：管理员

摘要：目的探究抗体-白细胞介素（IL）-2耦联物纳米药物（aT-IL2C NPs）对多发性硬化（MS）的作用及机制。方法建立MS经典动物模型实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）模型，小鼠出现明显症状时随机分为磷酸盐缓冲液（PBS）、抗TIGIT单克隆抗体（aTIGIT）+IL-2/抗IL-2单克隆抗体免疫复合物（JES6-1）、aTIGIT NPs+IL-2/JES6-1 NPs及aT-IL2C NPs组，分别在免疫后第10、12、14天进行静脉注射。监测各组临床评分及体质量变化。在免疫后第28天，进行脊髓组织快固兰染色，检测脊髓组织中免疫细胞水平及IL-10、转化生长因子（TGF）-β、IL-4、IL-17A、IL-22和IL-23水平。结果与对照组相比，aT-IL2C NPs组神经功能缺损评分显著降低（P<0.05）。aT-IL2C NPs组髓鞘白质染色均匀完整，脊髓组织CD4+ T细胞中调节性T细胞（Treg）的频率显著增加，CD4+ T细胞中Th17细胞显著降低，巨噬细胞/小胶质细胞频率显著降低脊髓组织IL-10、TGF-β和IL-4水平显著增加，IL-17A、IL-22和IL-23水平显著降低（均P<0.05）。结论 aT-IL2C NPs可能通过重塑Treg/Th17细胞平衡，降低疾病严重程度，为MS治疗提供新策略。

关键词：
中枢神经系统
多发性硬化
巨噬细胞/小胶质细胞
抗体-白细胞介素(IL)-2耦联物纳米药物
调节性T细胞
加入收藏

多发性硬化(MS)是一种中枢神经系统(CNS)白质炎症性脱髓鞘性自身免疫性疾病[1,2]。随着研究深入，中老年MS病例报道逐渐增多。目前MS具体病因尚不明确，但多项MS动物实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)模型和临床研究表明，调节性T细胞(Treg)/Th17细胞平衡是导致MS发生、进展的重要因素[3,4]。目前治疗主要是减轻症状严重程度，延缓疾病进展，但尚无可逆转或治愈MS的药物，因此，开发新的有效干预药物至关重要。本文作者团队之前设计了一种主动靶向并选择性扩增Treg细胞同时抑制效应细胞增殖的免疫调节纳米药物抗体-白细胞介素(IL)-2耦联物纳米药物(aT-IL2C NPs),已应用于预防性治疗EAE,显著延缓EAE发作时间，降低EAE严重程度[5]。然而，目前尚不清楚在EAE小鼠出现症状后应用aT-IL2C NPs是否具有保护作用。因此，本研究在小鼠出现EAE明显症状时给予aT-IL2C NPs治疗，观察其对EAE的作用及机制。

1、材料与方法

1.1实验动物

SPF级雌性C57BL/6小鼠，6～8 w, 16～18 g,购自北京维通利华实验动物技术有限公司，实验动物生产许可证编号：SCXK(京) 2021-0003,所有动物实验符合吉林大学动物福利与伦理委员会批准的方案。

1.2主要试剂

aT-IL2C NPs、抗TIGIT单克隆抗体(aTIGIT)NPs、IL-2/抗IL-2单克隆抗体免疫复合物(JES6-1) NPs、IL-2/JES6-1由本文作者团队成功合成；髓鞘少突胶质细胞糖蛋白35-55(MOG35-55多肽),序列MEVGWYRSPFSRVVHLYRNGK购自中国南京金斯瑞生物科技公司；完全弗氏佐剂(CFA)购自美国Sigma Aldrich公司；灭活结核杆菌冻干粉H37Ra购自美国BD Biosciences公司；百日咳毒素(PTX)购自美国List Biological Laboratories公司；流式抗体购自美国Biolegend公司；小鼠IL-10、转化生长因子(TGF)-β、IL-4、IL-17A、IL-22、IL-23酶联免疫吸附试验(ELISA)定量分析检测试剂盒购自美国Thermo Fisher Scientific公司。

1.3 aT-IL2C NPs疗效评估

首先建立EAE小鼠动物模型。将MOG35-55多肽溶解在无菌磷酸盐缓冲液(PBS)中，终浓度为2 mg/ml,然后与等体积的含有8 mg/ml的CFA溶液进行充分乳化至油包水状态。将200μl抗原乳液于脊柱旁4点皮下注射，并于造模当日及48 h后，腹腔注射300 ng PTX。EAE小鼠疾病表现明显时免疫后第10天(平均神经功能评分≥1)随机分4组(n=6),分别于免疫后第10、12、14天尾静脉注射PBS,aTIGIT+ IL-2/JES6-1(包含5 mg/kg aTIGIT、0.05 mg/kg IL-2和0.25 mg/kg JES6-1)、aTIGIT NPs+IL-2/JES6-1 NPs(包含5 mg/kg aTIGIT、0.05 mg/kg IL-2和0.25 mg/kg JES6-1)、aT-IL2C NPs(包含5 mg/kg aTIGIT、0.05 mg/kg IL-2和0.25 mg/kg JES6-1)。免疫后每天监测小鼠的神经功能评分和体质量变化，直至免疫后第28天。神经功能评分标准如下：0.0分：正常；0.5分：远端尾部无力；1.0分：尾部无力；1.5分：尾部无力及后肢无力；2.0分：单侧部分后肢瘫痪或共济失调；2.5分：双侧部分后肢瘫痪；3.0分：双侧后肢完全瘫痪或严重共济失调；3.5分：完全性双侧后肢瘫痪和部分前肢瘫痪；4.0分：垂死的(前肢和后肢完全瘫痪);5.0分：死亡。

1.4组织取材

建立EAE小鼠动物模型，根据1.3中方法分为4组(n=9)并进行相应治疗。在免疫后第28天，应用预冷PBS进行心脏灌注，随后获取脊髓组织。1只小鼠用于脊髓组织染色，4只小鼠用于检测脊髓组织中的免疫细胞，4只小鼠用于检测脊髓组织中的细胞因子。

1.5固蓝(LFB)染色

脊髓组织冰冻切片复温，浸泡于LFB染液中室温过夜，95%乙醇浸泡2 min去除多余染液，分化液分化15 s, 70%乙醇分色20 s,至灰白质清晰，蒸馏水冲洗，脱水，透明，中性树胶封片，使用Nikon数码显微摄影系统进行分析。

1.6流式细胞术检测免疫细胞水平

将脊髓组织与1 ml胶原酶(0.5 mg/ml)和DNase(50.0μg/ml)混合，37℃孵育30 min,研磨，离心，获取脊髓单细胞悬液，用于检测巨噬细胞/小胶质细胞。应用淋巴细胞分离液经梯度离心分离淋巴细胞，用于检测Treg和Th17细胞。

1.7 ELISA检测脊髓组织细胞因子水平

取小鼠脊髓组织制备匀浆，收集上清液。根据酶联免疫检测试剂盒的说明书，定量检测上清液中IL-10、TGF-β、IL-4、IL-17A、IL-22和IL-23水平。

1.8统计学方法

采用GraphPad Prism软件进行单因素方差分析、Tukey多重检验。

2、结果

2.1 aT-IL2C NPs治疗效果评估

在免疫后第10天，小鼠开始出现显著的MS症状(平均神经功能评分≥1)进行随机分组。免疫后第28天，与PBS组、aTIGIT+IL-2/JES6-1组、aTIGIT NPs+IL-2/JES6-1 NPs组相比，aT-IL2C NPs组神经功能缺损评分显著降低，体质量变化百分比明显增加(均P<0.05),见表1。LFB染色结果显示，PBS组脊髓白质中可见大量未着色的空泡，表明白质内髓鞘严重脱失。与PBS组相比，aTIGIT+IL-2/JES6-1组、aTIGIT NPs+IL-2/JES6-1 NPs组髓鞘LFB染色略有增加，而aT-IL2C NPs组髓鞘白质染色均匀，更为完整，见图1。

表1各组神经功能评分、体质量变化百分比及脊髓中免疫细胞比较

图1各组脊髓白质(LFB染色，×200)

2.2脊髓组织免疫细胞浸润分析

免疫后第28天时，与PBS组、aTIGIT+IL-2/JES6-1组、aTIGIT NPs+IL-2/JES6-1 NPs组相比，aT-IL2C NPs组脊髓组织CD4+T细胞中Treg细胞的频率显著增加，CD4+T细胞中Th17细胞显著降低，巨噬细胞/小胶质细胞频率显著降低(P<0.05),见表1。

2.3脊髓组织细胞因子分析

免疫后第28天时，与PBS组、aTIGIT+IL-2/JES6-1组、aTIGIT NPs+IL-2/JES6-1 NPs组相比，aT-IL2C NPs组脊髓组织IL-10、TGF-β和IL-4水平显著增加(P<0.05),IL-17A、IL-22和IL-23水平显著降低(P<0.05),见表2。

表2各组脊髓中细胞因子水平比较

3、讨论

MS是一种自身免疫性疾病，自身反应性免疫细胞识别并攻击CNS神经周围的保护性髓鞘，导致疾病的发生发展，造成CNS不可逆损伤，从而影响运动、感觉、视力和认知功能等[6]。目前这种终身疾病是无法治愈的，并且由于当前治疗方案对免疫系统抑制选择性差，常常导致患者免疫力下降[7]。鉴于传统免疫抑制剂的副作用，人们正在积极探索能够作用于特定免疫细胞，而不干扰其他免疫活动的新疗法。aT-IL2C NPs在EAE模型中预防性治疗取得显著效果。

本研究结果表明，aT-IL2C NPs可以显著降低EAE严重程度。同样，体质量变化也表明aT-IL2C NPs发挥了优越的治疗效果。MS的关键特征是CNS白质脱髓鞘[8,9],aT-IL2C NPs治疗有效地抑制脱髓鞘过程。

Treg/Th17细胞失衡是参与MS发生发展重要病理生理机制，影响MS患者疾病发展方向[10～12]。本研究结果表明，aT-IL2C NPs显著增加Treg细胞比例，显著降低Th17细胞比例，重塑Treg/Th17细胞平衡，从而调节免疫耐受。巨噬细胞/小胶质细胞是CNS主要免疫细胞，是组织稳态和炎症的关键协调者[13],在MS患者中，巨噬细胞/小胶质细胞活化，发挥致病作用[14]。本研究结果表明，aT-IL2C NPs显著降低巨噬细胞/小胶质细胞浸润，协同抑制神经炎症反应，促进神经修复，aT-IL2C NPs能有效调控EAE小鼠模型中的炎症微环境。

综上，应用aT-IL2C NPs治疗显著增加Treg细胞比例，显著降低Th17细胞比例，提示aT-IL2C NPs可能通过重塑Treg/Th17细胞平衡，纠正炎症微环境，从而改善EAE疾病严重程度，表现出显著的神经保护作用。

基金资助:吉林省科技厅国际合作项目(20240402020GH);吉林省财政厅卫生科研人才专项(2023SCZ13);

文章来源:王楚衡,王晓爽,安晶,等.抗体-IL-2耦联物纳米药物对多发性硬化的作用及机制[J].中国老年学杂志,2024,44(21):5298-5300.