急性疼痛也称伤害型感觉疼痛，是指近期产生且持续时间较短的疼痛[1]。急性疼痛往往与疾病或损伤有一定关系，特别是开放式手术术后24～48 h内发生的概率较大[2]。在临床上，急性疼痛的治疗往往被忽视，对于此类患者早期不充分的疼痛治疗会导致创伤愈合延迟、功能恢复降低、免疫功能受损，甚至残疾。

布比卡因是临床上广泛使用的酰胺类局部麻醉剂，医学上经常用其盐酸盐(bupivacaine hydrochloride, BH)。此药通过升高神经动作电位的阈值，达到麻醉和镇痛的效果[3]。相比于阿片类镇痛药物，布比卡因的使用不易导致成瘾性。多聚脱氧核糖核苷酸(polydeoxyribonudeotide, PDRN)是一种可靠的细胞生长活性物质，具有促进组织再生、有效缓解炎症的功能，在人体皮肤、韧带和肌腱的再生修复方面效果显著[4-5]。其常用于医美行业，将这2种药物联合使用，在疼痛领域是一种新的尝试，联合使用提升了单一药物的治疗效果，减轻了患者所感受到的急性疼痛，降低了因患者活动而导致伤口难以愈合的风险。

原位凝胶又称在位凝胶、即位凝胶。它是一类以溶液状态给药，在用药部位受到外界刺激发生响应，进而迅速相变形成半固体状态的新型制剂[6]。原位凝胶广泛应用于缓控释给药系统。其优势众多，如特殊的理化性质、良好的生物相容性、优越的生物黏附性、高含水性等[7]。本研究中，针对创伤所导致的急性疼痛和伤口开放的治疗采用盐酸布比卡因和多聚脱氧核糖核苷酸温敏凝胶，以泊洛沙姆407、泊洛沙姆188、氯化钠的浓度作为考察因素，单因素法确定优化区域，星点设计-效应面法进一步优化处方，所得的最优处方再进行体内外质量评价，评估其是否能满足长效镇痛、促愈合制剂的基础需求。

1、材料与方法

1仪器

MS204TS/02电子天平(梅特勒-托利多仪器有限公司);DZKWC恒温水浴锅(上海树立仪器仪表有限公司);S210 pH计(梅特勒-托利多仪器有限公司);SHZ88水浴恒温振荡器(江苏金怡仪器科技有限公司);ViscoQC 300L黏度计(安东帕公司);UV2550紫外分光光度计(日本岛津公司);LC10ATVP Plus高效液相色谱仪(日本岛津公司);DWHL398G超低温冷冻储存箱(中科美菱低温科技股份有限公司);sZFD20A冷冻干燥机(上海舜制仪器制造有限公司);GeminiSEM 300场发射扫描电子显微镜(德国蔡司公司);TG16高速离心机(上海卢湘仪离心机仪器公司);LATHH4实验动物通风笼盒饲养系统(北京莱艾特科技发展有限公司);BP80皮肤打孔器(南京强科生物技术有限公司)。

2试剂

盐酸布比卡因(济南诚汇双达化工有限公司，批号：28220201,纯度：99.53%);多聚脱氧核糖核苷酸[润辉生物技术(威海)有限公司，批号：RN04-220701,纯度：99.9%,相对分子质量：120 kDa];泊洛沙姆407(BASF公司，批号：GNE03821B);泊洛沙姆188(BASF公司，批号：GNE32721B);氯化钠(大茂化学试剂有限公司，批号：20220504);盐酸布比卡因对照品(中国食品药品检定研究院，批号：101034-202103,纯度：94.6%);罗丹明B(麦克林生化科技股份有限公司，批号：C15205928);0.9%氯化钠注射液(山东齐都药业有限公司，批号：8C230901022);葡萄糖[康美保宁(四川)制药有限公司，批号：230206];青霉素V钾片(华北制药股份有限公司，批号：V3081201);乌来糖(国药集团化学试剂有限公司，批号：20221124);其余试剂均为分析纯。

3实验动物

雄性SD大鼠，体重(200±20) g,购自济南朋悦实验动物繁育有限公司，动物许可证号：SCXK(鲁)20220006。本研究中的动物实验得到了中国海洋大学医药学院伦理委员会的批准和支持(编号：OUC-2021-0301-02),符合《实验动物护理和使用指南》(国家科学院出版社，2011年第8版)。实验前饲养3 d,期间不禁食禁水。

4方法

4.1载药温敏凝胶的制备

称取质量浓度为2.5%的盐酸布比卡因和0.5%的多聚脱氧核糖核苷酸于蒸馏水中，35℃条件下使其充分溶解。再加入处方量氯化钠、泊洛沙姆188,溶解完成后转移至冰浴环境下，边搅拌边加入泊洛沙姆407,最后将混合溶液置于4℃的冰箱中24 h,充分溶胀后所得无色澄清透明溶液即为载药温敏凝胶溶液。

4.2载药温敏凝胶的质量性质评价

4.2.1胶凝温度

取2 mL样品，将其放入恒温水浴锅。设置初始温度25℃,逐渐升温至50℃。每次升温0.5℃,达到指定温度后稳定5 min,再翻转离心管，观察样品是否已成胶态不倒流，以30 s不倒流的温度记为该样品的胶凝温度[8]。平行实验3次，结果取平均值。

4.2.2胶凝时间

取2 mL样品，将其放入37℃恒温水浴锅，从0开始计时至300 s,每15 s倒转1次试管，以样品成胶态不倒流时间记为胶凝时间[9]。平行实验3次，结果取平均值。

4.2.3 pH值

按照《中华人民共和国药典》2020年版第四部通则0631中的方法测定，平行实验3次，结果取平均值。

4.2.4黏度

利用旋转黏度计测定样品在4℃及25℃下的黏度，平行实验3次，结果取平均值。

4.2.5可注射性能

在室温环境下，取部分用罗丹明B染色样品置入5 mL的注射器中，依次在注射器上放置4.5,5,6,7号的针头，推动注射器，感受推动过程是否存在明显的堵塞和起泡感。将其注入水中后，仔细观察样品的挤压形态并进行摄影记录。同时利用注射器将凝胶样品书写成“OUC”字母的形状，以此来考察样品的可注射性能。

4.2.6持水性能

吸取1 mL样品，将其放入预先称重的离心管内，记录样品初始的总重量。在高温环境下，确保样品完全成形后，以12 000 r·min-1的速度进行离心样品10 min,接着用滤纸谨慎地吸附凝胶中渗出的水分，最后测量离心管的整体重量。持水率是通过比较优选制剂前后的重量比例来计算的[10]。平行实验3次，结果取平均值。

4.2.7药物的体外释放

采用无膜溶出法进行实验，平行实验3次，结果取平均值[11-12]。取3份1 mL样品于10 mL离心管中，称取初始重量，再将离心管放入37℃水浴恒温振荡器，固化10 min。分别向离心管中加入5 mL介质，设置振荡器振荡速度为50 r·min-1,开始计时振荡，在1,2,4,8,24,48,72,96 h时分别取0.5 mL溶出液，并补充0.5 mL新鲜介质，利用高效液相色谱仪及紫外分光光度计进行分析。

4.2.8扫描电子显微镜(scanning electron microscope, SEM)表征

取部分样品预热成胶态，放入-80℃ 冰箱冷冻1 h,再转入真空冷冻干燥机冻干24 h,得到样品后喷金处理，在加速电压5.0 kV的条件下利用场扫描电镜观察不同倍镜下凝胶内部的微观形态[13]。

4.2.9开放性伤口模型

选用20只250 g左右的雄性SD大鼠，将大鼠平均分为5组，组1为模型组，打孔后仅用生理盐水清洗创口。组2为空白凝胶组，组3为BH/gel组，组4为PDRN/gel组，组5为BH-PDRN/gel组。除组1无需给予样品外，组2～组5在打孔后均需给予0.1 mL样品。在打孔前，剃除大鼠打孔部位的毛发，并用脱毛膏处理背部毛囊。d 0,向大鼠腹腔注射1.2～1.4 mL 20%乌来糖，确认大鼠完全麻醉后，使用皮肤打孔器在大鼠背部进行打孔并给药0.1 mL。给药后用pu防水贴覆盖伤口，并将大鼠分笼饲养(腹腔注射1 mL青霉素)。在d 0时喂食5%葡萄糖溶液，并在d 3,d 5,d 7,d 10时外加标尺，拍照记录大鼠创口的愈合情况[14-15]。以d 1,d 3大鼠的体重、毛发、粪便、自主行动能力等评价指标评价大鼠的疼痛感。

2、结 果

1单因素法

采用单因素法考察各组分对胶凝温度、胶凝时间的影响，药物含量为定值，其中盐酸布比卡因的质量浓度为2.5%,多聚脱氧核糖核苷酸的质量浓度为0.5%。

1.1单因素考察P407

不添加P188及氯化钠，测定P407从浓度14%到21%的载药凝胶的胶凝温度、胶凝时间。结果见表1。

数据表示为平均值±标准误；同一列不同小写字母代表差异显著(单因素方差分析，P<0.05);n=3

表1泊洛沙姆407浓度筛选

1.2单因素考察P188

不添加氯化钠，P407的浓度固定为16%,20%,测定P188从浓度1%到6%的载药凝胶的胶凝温度，测定结果见表2。

数据表示为平均值±标准误；同一列不同小写字母代表差异显著(单因素方差分析，P<0.05);n=3

表2泊洛沙姆188浓度筛选

1.3单因素考察氯化钠

P407的浓度固定为16%,P188的浓度固定为1%,测定氯化钠从浓度0.2%到0.8%的载药凝胶的胶凝温度，测定结果见表3。

数据表示为平均值±标准误；同一列不同小写字母代表差异显著(单因素方差分析，P<0.05);n=3

表3氯化钠浓度筛选

从单因素实验结果来看，在选定的因素范围内，随着P407的浓度上升，体系的胶凝温度和时间都有所下降，与P407浓度的变化呈现负向关联。这是由于体系内聚合物的体积分数上升、胶束数量的增多以及缠结概率的提高所引起的。而胶凝时间与温度本身具有一定的相关性，在相同温度条件下，具有低临界相转变温度(lower critical solution temperature, LCST)的体系更易到达临界点并展现出凝胶状态。尽管15% P407已达到较适宜的胶凝温度，但该处方胶凝时间较长，且由单一P407组成的制剂机械性能较差。考虑到相关因素，引入温度调节剂P188及黏度调节剂氯化钠，通过辅料组合进一步调整体系的胶凝温度及胶凝时间，同时确定制剂中P407的优选浓度范围为16%～20%。

此外，根据表2结果显示，随着P188浓度的上升，该体系的胶凝温度和胶凝时间相应增加，与P188浓度的变化表现出正相关性。P407和P188都属于泊洛沙姆系列的物质，它们之间的主要差异体现在亲疏水嵌段的比例上，在P188中，亲水嵌段聚环氧乙烷(polyethylene oxide, PEO)与疏水嵌段聚环氧丙烷(poly[oxy(methyl-1,2-ethanediyl)],PPO)的比例大约是8∶2,而在P407中，这一比例大约是7∶3[16]。当P188被加入体系中后，亲水嵌段的比例会相应地增加。而泊洛沙姆凝胶系统的胶凝过程主要受到疏水嵌段PP0的驱动作用。因此，随着PEO的比例上升，系统的胶凝温度和胶凝时间都会增加。当P407的质量浓度达到20%时，通过添加6%的P188,可以将系统的温度调整到34℃,这比理想的胶凝温度要高出1℃～2℃,因此，在制剂中，P188的最佳浓度范围被确定为1%～5%。

加入氯化钠有助于泊洛沙姆体系从溶液状态迅速转变为凝胶状态，这被视为一种限制药物突释的策略[17]。根据表3结果所示，当氯化钠浓度在0.2%～0.4%的范围内增加时，整个体系的胶凝温度和胶凝时间都会显著下降。但当氯化钠浓度在0.4%～0.8%的范围内增加时，胶凝时间会显著下降，而胶凝温度之间并没有明显的差异，这可能是与氯化钠的作用机制相关，作为一种电解质，氯化钠通过增加溶液的离子强度，导致体系的静电排斥力增强，而对胶凝温度的影响则受泊洛沙姆本身热敏性的限制[18]。当氯化钠浓度为0.8%时，其胶凝时间与浓度0.6%时情况相近，因此确定制剂中氯化钠的优选范围为0.2%～0.6%。

为了能够设计出在体温条件下迅速响应(胶凝温度为32℃,胶凝时间30～90 s)的温敏凝胶样品，选取P407浓度16%～20%,P188浓度1%～5%,氯化钠浓度0.2%～0.6%为单因素优选范围进行星点设计。

2含量测定

2.1测定盐酸布比卡因色谱条件及方法学考察

利用高效液相色谱仪进行考察，色谱柱为Titank C18色谱柱(250 mm×4.6 mm, 5μm),以乙腈-0.02 mol磷酸盐(65∶35)为流动相；流速1.0 mL·min-1;柱温35℃;检测波长240 nm;进样量20μL。在该色谱条件下，盐酸布比卡因保留时间为11 min,其余成分不干扰盐酸布比卡因的测定，专属性良好。配制50,100,250,500,750,1 000μg·mL-1的系列浓度标准溶液，各取20μL注入高效液相色谱仪，记录色谱图，以峰面积(A)对浓度(C,μg·mL-1)进行线性回归，得到盐酸布比卡因的标准曲线方程为A=5 577.7C+254 501,r=0.998 2,结果显示，盐酸布比卡因在50～1 000μg·mL-1浓度范围内与其峰面积呈良好的线性关系。精密度RSD=0.58%(n=6),日内稳定性RSD=0.89%(n=12),日间稳定性RSD=1.60%(n=12)。

2.2测定多聚脱氧核糖核苷酸色谱条件及方法学考察

利用紫外分光光度计进行考察，紫外检测波长260 nm,利用溶出介质配制10,20,30,40,50μg·mL-1的系列浓度标准溶液，记录吸光度，以吸光度(A)对浓度(C,μg·mL-1)进行线性回归，得到多聚脱氧核糖核苷酸的标准方程为A=0.020 2C-0.070 2,r=0.999 4,结果显示，多聚脱氧核糖核苷酸在10～50μg·mL-1浓度范围内与其吸光度呈良好的线性关系。

3星点设计响应面法

3.1确定因素水平

采用星点设计-响应面法，选择P407浓度(A)、P188浓度(B)、氯化钠浓度(C)作为考察因素，16%～20%,1%～5%,0.2%～0.6%分别为因素的因素范围，以胶凝温度为响应指标1。由于凝胶基质的不同处方组合影响了药物的累积释放度，因此增加活性成分盐酸布比卡因在PH=7.4的介质中的1及72 h药物累积释放度作为响应指标2,3,优化处方每个因素设置5水平(见表4)。实验设计方案与结果见表5。

表4因素与水平

表5星点设计及响应值

用Design-Expert 13.0.1.0软件，以A,B,C这3个因素对T,RLS(1 h)、RLS(72 h)这3个响应值进行回归方程拟合，拟合结果如下。

T=31.92-4.78A+3.11B-1.45C-0.375 0AB+0.085 0AC-0.832 5BC-0.079 9A2-0.847 1B2-0.995 6C2(P<0.000 1)

RLS(1 h)=5.15+0.639 9A+1.01B-1.10C+1.03AB+0.497 5AC-0.380 0BC+2.50A2-0.146 3B2+0.315 1C2(P=0.001 6)

RLS(72 h)=61.38+4.63A+2.03B-3.66C+0.682 5AB-0.545 0AC-1.14BC+4.32A2-0.024 9B2+0.427 7C2(P=0.009 1)

分析结果显示3个模型值P均<0.01,模型可靠有效。因素对响应值的三维效应面图见图1、图2、图3。

图1因素AB,AC,BC对胶凝温度影响的三维效应面图(从左至右)

图2因素AB,AC,BC对RLS-1 h影响的三维效应面图(从左至右)

图3因素AB,AC,BC对RLS-72 h影响的三维效应面图(从左至右)

3.2处方验证

设定目标胶凝温度32℃,药物累积释放1,72 h分别取最小值4.375%,57.301%,模型拟合获得优化处方：P407浓度为17.468%,P188浓度为3.233%,氯化钠浓度为0.519%。依据最优处方平行配制3组样品，胶凝温度及1,72 h药物累积释放度结果见表6。实际胶凝温度为(31.33±0.24)℃,1 h药物累积释放度为(3.78±0.45)%,72 h药物累积释放度为(3.78±0.45)%,(58.72±2.23)%。预测值与实际值之间偏差均<5%,模型预测良好。

表6模型验证结果n=3

3.3质量指标评价

3.3.1外观

在常温条件，优选制剂样品为无色、清澈、透明的溶液形态，并在倾斜的西林瓶中展现出流动性。当外部温度上升到胶凝温度时，该制剂表现为半固态的凝胶形态，不随瓶身倾斜而流动，说明此时制剂已经完成了从溶液状态到凝胶状态的相变过程。见图4。

图4样品常温及胶凝温度条件下的外观形态

3.3.2胶凝时间、pH值、黏度

优选制剂样品胶凝时间为(55±7.07) s, pH值为(5.52±0.01),4℃黏度为(185.2±13.53) mPa·s, 25℃黏度为(574.8±14.53) mPa·s。见表7。

表7相关质量指标测定结果n=3

3.3.3可注射性能

在常温条件下，当推动优选制剂样品经过4.5,5,6,7号针头时，并未感受到明显的阻塞或起泡迹象。通过对样品的水下注入实验，可观察到经注射器针头挤压后，样本呈现出良好的线性外观。此外，通过精确控制针头，可以准确书写“OUC”组合字母，这都证明了样品具有出色的可注射性能。见图5。

图5样品水下注射形态观察及书写能力测试

3.3.4持水性能

根据离心前后优选制剂样品凝胶部分的重量变化确定样品的持水能力，测定所得样品的持水率为(98.45±0.44)%,说明当制剂相转变形成凝胶后，其持水能力良好。

3.3.5药物的体外释放

正常皮肤的pH值在4.5～6.5范围内振荡，是一种弱酸性环境，有助于皮肤保持健康。而开放性创口因其血管渗漏、发生炎症和感染，导致伤口具有连续的碱性环境(pH值为6～7.4)。因此，除载药温敏凝胶在pH=7.4介质中的释放外，增加优选处方在pH=6.8介质、纯水介质中的释放考察，所得结果见图6及图7。

图6不同介质中盐酸布比卡因药物累积释放度

图7不同介质中多聚脱氧核糖核苷酸药物累积释放度

从药物体外释放结果可知，在3种与创口pH相近的介质中，优选处方所制备的载药凝胶均能缓慢释放药物，药物体外释放时间长达72 h以上，能够覆盖术后疼痛出现的高发期。且在1 h内药物无明显突释现象发生，降低了高浓度药物的毒性风险。以上结果表明该处方具有良好的缓释效果及应用价值。

3.3.6 SEM表征

通过场发射扫描电子显微镜对冻干后载药泊洛沙姆凝胶的微观结构进行观察(见图8),发现载药凝胶为三维交联的聚合物网状结构，聚合物交联时形成了大小不等的孔隙。

图8优选处方内部微观形态

3.3.7开放性伤口模型

通过对模型组伤口愈合过程的观察，注意到伤口愈合在某种程度上具有自限性。在没有使用任何药物的情况下，从d 5～d 10,大鼠的伤口逐步进入了自我修复的阶段。因此，在探究不同组别样品对伤口愈合速度的影响时，应该特别关注d 1～d 5期间不同组别大鼠伤口愈合的具体情况。从图9、图10和表8中可以观察到，PDRN/gel组和BH-PDRN/gel在伤口愈合速度方面明显优于其他3组。通过比较d 3不同组别的大鼠伤口愈合情况，发现PDRN/gel组和BH-PDRN/gel组在加速大鼠伤口愈合方面具有一定程度的相似性，两组在d 3的伤口平均愈合率分别达到了46.27%和48.23%。这项研究发现，在复方制剂样品中PDRN被认为是加速伤口恢复的关键活性成分。此外通过对大鼠术后状态的深入观察发现，在开放性伤口造模后的1～3 d,大鼠表现出体重减轻(与造模前相比)、粪便量减少(与正常大鼠相比)、毛发直立以及自主进食行为下降的现象。随后，我们对这些变化进行记录并分析。从表9中对不同组别的大鼠进行手术后状态的比较发现，添加了盐酸布比卡因这一活性成分的组别，其大鼠在术后的自主行为有了明显的改善，从体重、粪便量以及毛发的状况来看，加入这种有效成分能够改善大鼠的术后的舒适度，这对于伤口的恢复有益。因此当被应用于伤口治疗时，BH-PDRN/gel组的选择能更有效地缓解疼痛并加速伤口的愈合过程。

表8不同组别大鼠伤口愈合率

图9不同组别样品对创伤愈合速度的影响

图10不同组别样品创面愈合叠加图

表9大鼠术后72 h内疼痛感评价表

3、讨 论

本研究深入分析了P407、P188、氯化钠对胶凝温度、胶凝时间和药物释放度的具体影响，目的是为设计具有理想质量特性的原位凝胶产品提供更精准的方案。通过结合单因素法与星点设计-效应面法，可以在处方优化的过程中连续地分析各种变量的作用，并在此过程中充分考虑到实验可能产生的随机误差。这一筛选方法不只是操作流程简洁，其数据也极为明确和直接，同时还拥有出色的预测性能。

经过多个质量属性的验证，模型筛选出的最优配方已经达到了实验设计的要求。从胶凝温度和时间角度来看，优选配方可以在室温条件下以溶液形式保存，这不仅方便了准确取用，还降低了存储和运输的成本。此外胶凝时间在0～60 s范围内，这表明该制剂能在体温下迅速形成胶状物质，从而减少了因胶凝时间过长导致的药液损失或药物突释的风险[18]。从pH值的角度分析，优选配方提供了一个微酸性的pH值环境，相关研究表明微酸性pH值(5.5～6.5)环境有助于抑制细菌的感染并促进血管的再生[19-20]。从黏度和可注射性的角度考虑，较低的黏度和出色的注射性能使得产品能够适应各种多种不同的伤口类型，进一步拓宽了产品的应用领域。从药物的内部结构和其在体外的释放情况来看，优选配方形成了相互交联的三维网状结构，这种物理屏障能够有效地延长药物的释放时间，降低重复给药频率，提高患者对药物的依从性。此外，药效学的研究结果表明，采用复方制剂给药方式，与单一活性成分相比，可以实现镇痛和加速愈合的双重效果，为大鼠开放性创口术后的疼痛和伤口愈合问题提供了有效的解决方案。

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