糖尿病是严重危害人类健康的代谢性疾病，且发病率呈现逐年升高的趋势。2021年我国糖尿病患者已达1.41亿人，位居全球第1位[1]。其中20%～40%的糖尿病患者罹患糖尿病肾病并发症[2]。现有的降糖药物中，钠–葡萄糖协同转运蛋白2(SGLT-2）抑制剂已获临床验证具有明显的肾脏保护作用，但其固有的生殖、泌尿系统感染风险限制了其运用[3]。而研究表明二肽基肽酶-4(DPP-4）抑制剂可降低与SGLT-2抑制剂相关的泌尿生殖道感染风险[4]。并且与DPP-4和SGLT-2单独抑制相比，双靶点抑制能显著降低血糖、糖化血红蛋白（Hb A1c）水平，增加血浆胰岛素水平，并改善肾功能[5]。

DPP-4抑制剂和SGLT-2抑制剂在降糖机制上也有着明显的协同作用，DPP-4抑制剂可升高内源性胰高血糖素样肽-1(GLP-1）水平，而GLP-1可与位于胰岛β细胞表面的GLP-1受体（GLP-1R）结合并介导其释放胰岛素，从而降低血糖水平[6]。SGLT-2抑制剂主要作用于肾脏近曲小管的SGLT-2受体（SGLT-2R），抑制其对葡萄糖的重吸收，增加尿糖的排泄，从而降低血糖水平[7]。基于SGLT-2抑制剂，结合DPP-4抑制剂的特点设计DPP-4和SGLT-2双靶点抑制剂可以在降低葡萄糖在肾脏中重吸收的基础上，同时减缓DPP-4对GLP-1的灭活作用，起到双重作用机制发挥叠加效果的目的，在达到相当降糖效果的同时，减轻泌尿系统感染的不良反应。不仅具有肾脏获益，也避免了联合用药的药物相互作用，增强了患者的依从性降低药物的耐药性及不良反应。目前已有DPP-4和SGLT-2双靶点抑制剂进入临床研究阶段。如中国盛世泰科生物医药技术（苏州）有限公司的创新药CGT-2201目前已获得国家药品监督管理局临床试验默示许可。因此开发SGLT-2/DPP-4双靶点抑制剂具有重要临床意义。本研究通过机器学习、虚拟筛选、分子对接和分子动力学模拟方法寻找新型DPP-4/SGLT-2双靶点抑制剂。

1、材料与方法

1.1 数据准备与使用软件

从Drug Bank数据库（https://go.drugbank.com）及Pub Med数据库（https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov）中下载已经批准上市的DPP-4和SGLT-2抑制剂，再下载数据库中活性排名靠前的小分子作为训练集构建药效团模型。

从Binding DB数据库（https://www.bindingdb.org）中以“DPP4”“SGLT2”为关键词检索到6 896个DPP-4相关的化合物和1 271个SGLT-2相关的化合物，其中半数抑制浓度（IC50）值小于100μmol/L且具有DPP-4和SGLT-2选择性抑制的小分子分别有4 036个和70个。

诱饵集数据库共100个小分子，由10个活性分子和90个非活性分子组成，非活性分子来自Binding DB数据库中IC50>200μmol/L的小分子。活性分子来自Binding DB数据库中IC50<200nmol/L的小分子。10个活性DPP-4和SGLT-2抑制剂与训练集中的化合物不同，用YA01～YA10编号10个活性分子，用YI11～YI100编号90个非活性分子。

DPP-4晶体结构（PDBID:3G0B)[8]、SGLT-2晶体结构（PDBID:7VSI)[9]来源于PDB蛋白数据库（https://www.rcsb.org）。用于虚拟筛选的7 494个化合物来源于Bi RNN模型（https://github.com/ETHmodlab/BIMODAL）。药效团构建、分子对接、虚拟筛选及ADMET活性预测等使用Discovery Studio 3.5软件和Schrödinger 2020软件完成，并使用Pymol软件进行可视化。使用Rdkit插件（https://github.com/rdkit/rdkit）计算化合物的可合成性（SA）、类药性（QED）和相对分子质量（Mr）等理化性质。分子动力学模拟以及结合自由能的计算使用GROMACS 2022版本进行，使用Qt Grace软件对轨迹进行分析，计算配置见表1。

表1 分子模拟工作站配置

1.2 实验方法

1.2.1 基于Bi RNN的DPP-4与SGLT-2双靶点抑制剂的生成

本研究使用基于Tensorflow的双向循环神经网络模型生成了具有潜在双靶点抑制活性的新型小分子。具体方法如下：分别下载1.1中Binding DB数据库检索的IC50值小于100μmol/L且具有DPP-4和SGLT-2选择性抑制的小分子二维结构，并使用Schrodinger软件包中的Maestro软件将抑制剂转化为smiles格式，用于特征学习，采集的化合物共4 106个。由于DPP-4与SGLT-2抑制剂数量相差较大，本研究对DPP-4抑制剂使用Pipeline Pilot中的分子相似性模块进行了聚类分析，将所有分子分为70类，并从每类中选择1个代表性分子与70个SGLT-2抑制剂融合。

基于片段药物设计的方法，使用匹配分子对算法（MMP）对SGLT-2和DPP-4抑制剂进行了拆分，共形成了71组不同的分子对；随后，将分子对转化为smile结构描述符，并使用Random Smile方法对其进行了扩充，最终形成了包含23 500个分子对的骨架–装饰片段库。将片段库中的分子对以8∶1∶1的比例，分为训练集（80%）、测试集（10%）和验证集（10%），不同组之间的化合物没有重叠。在使用训练集和验证集对模型进行训练和参数优化调整的同时，使用测试集对模型的预测准确性（valid accuracy）进行分析。为了充分认识SGLT-2以及DPP4抑制剂中不同结构的连接特征，使用Bi RNN构建了含有4个隐藏层以及1 272 967个可调节参数的分子生成模型。模型训练结束后，使用优化后的模型进行了模拟采样，共进行10 000次采样。采样得到的分子使用RDkit软件包中的rdinchi模块计算分子的inchi描述符，并去掉重复分子。得到的分子储存为SDF格式用于下一步分析，流程见图1。

图1 基于Bi RNN的组合化学分子设计流程

1.2.2 基于分子共同特征的药效团模型（Hip Hop）构建

利用DS软件中的Prepare Ligand模块分别处理1.1项下中的20个药效团训练集小分子，参数Max Omit Feat设定为0,Principal设定为2，表明构建Hip Hop药效团时，20个训练集分子均被定义成有活性的参考分子，且药效团模型中所有特征元素需与训练集化合物相匹配，使用Feature Mapping选取药效团的特征元素。利用Common Feature Pharmacophore Generation模块构建Hip Hop药效团，模式选择BEST，能量阈值Energy Threshold设置为10,Maximum Conformation设置为200，其他参数默认。

1.2.3 药效团模型的验证

通过测试集分子（测试集包括活性分子、非活性分子）对药效团模型可靠性进行评价，利用Ligand Profiler模块将2个靶点的100个测试集分子分别叠合到生成的10个药效团模型中，确保运行参数与药效团构建设定参数相同。计算10个药效团模型的活性命中率（YA），并引入富集因子（EF）与拟合优度分数（GH）评价所生成的药效团模型，其中YA反映药效团筛选结果的准确性，EF反映可靠性，GH反映稳定性，表明筛选数据具有统计学意义，具体计算公式如下[10]。

其中N代表测试集中总分子数，数值为100;n代表测试集中活性分子数，数值为10;Ht代表命中分子数；Ha代表命中分子中的活性分子数。为了评价药效团模型对测试集中活性分子和非活性分子的区分能力，进行了测试集热图验证。热图验证中热图的横坐标代表药效团编号，纵坐标代表药效团模型与小分子的匹配程度（Fit value），冷色调表明Fit value值高，匹配度好，暖色调则表示Fit value值低，匹配度差，Fit value值低于1视为很难匹配或不匹配。

1.2.4 基于药效团的虚拟筛选

使用Discovery Studio 3.5软件中的Search 3D Database模块将Bi RNN模型生成的小分子分别叠合到选中的药效团模型中，筛选出药效团Fit value>1，可与药效团特征相匹配的小分子，再对筛选后的小分子取交集得到初筛小分子。

1.2.5 初筛小分子对接研究

使用Schrödinger软件中的Glide模块将初筛小分子与DPP-4和SGLT-2分别进行高精度（XP）对接。蛋白质格点文件以3G0B和7VSI蛋白结构中的结晶分子为网格中心，网格框定义为20Å×20Å×20Å（1Å=0.1 nm），使用Receptor Grid Generation生成格点文件用于对接，其他参数保持默认值。设置好合适的参数后，将晶体结构中的配体分子提取出来并重新对接至预先定义好的对接盒子内。将对接后配体与原复合物晶体结构中的配体构象进行对比，通过计算均方根偏差（RMSD）验证所设定的对接参数的可靠性。取各打分值前2%的小分子再取交集得到备选小分子。

1.2.6备选小分子ADMET预测

药动学研究(ADMET）是对药物的吸收、分布、代谢、排泄和毒性的全面研究，是研究药物体内过程的重要方法，也是药物筛选中需要考虑的重要标准。DS软件自带ADMET预测模块，可以对输入的小分子化合物进行ADMET性质预测，主要包括6项参数：25℃水溶解度（solubility）、血脑屏障通透性（BBB）、细胞色素P4502D6抑制性（cytochrome P4502D6inhibition）、肝毒性（hepatotoxicity）、肠道吸收（absorption）和血浆蛋白结合率（plasma protein binding,PPB）。其中absorption、solubility与BBB3项以相关等级表示。利用DS软件中的Calculate Molecular Properties模块，点击ADMET Descriptors模块，对备选小分子进行ADMET活性预测。

1.2.7 备选小分子可合成性、类药性分析

为了评价生成分子的质量，使用Rdkit插件（https://github.com/rdkit/rdkit）计算化合物的SA、QED和Mr等理化性质[11]。

1.2.8 备选小分子动力学模拟研究

分子动力学模拟（MD）采用Gromacs 2022程序，将备选小分子对接的结果作为分子动力学模拟的初始构象。选择CHARMM36力场。使用Avogadro程序对所有备选分子添加氢原子并进行去质子化。使用Cgen FF网站对小分子施加力场。然后，将复合物溶剂化成1 nm厚距离蛋白质10Å的SPC水分子立方体盒（cubic box），盒内填充TIP3P水模型。向受体–配体–溶剂体系中添加Na+和Cl-以保持电中性，并在所有方向上施加周期性边界条件（PBC）以避免在模拟过程中的边缘效应。用Particle-Mesh-Ewald(PME）算法计算长程静电相互作用。对系统进行能量最小化。体系能量优化后，在100 ps的等温（300 K）和等压（1atm）条件下进行NVT和NPT系综以平衡系统。以2 fs时间步长进行100 ns的分子动力学模拟[12]。模拟结束后，使用Qt Grace软件分别分析每个复合物的均方根误差（RMSD）和蛋白质氨基酸残基的均方根波动（RMSF）。采用分子力学/泊松-玻尔兹曼表面积（MM/PBSA）方法计算模拟过程最后10 ns中每一帧的结合自由能并取均值进行对比分析[13]，验证在动态溶剂环境中的结合能力。

2、结果

2.1 训练集药效团模型的筛选

经Drug Bank、Pub Med数据库筛选得到已经批准上市的DPP-4抑制剂12个和SGLT-2抑制剂9个，另选取数据库中活性排名靠前的小分子补充至20个作为训练集构建药效团模型，见表2、3。

2.2 DPP-4和SGLT-2与已知抑制剂的关键相互作用模式分析

本研究对3G0B、7VSI复合物结构进行了构效分析。在DPP-4的活性口袋中，阿格列汀（alogliptin）哌嗪基的NH与氨基酸Glu 205/206之间存在氢键相互作用；氨基酸Tyr 631与杂环的羰基之间存在氢键；氰基与氨基酸Arg 125形成的氢键相互作用[4]，见图2A。在SGLT-2的活性口袋中，恩格列净（Empagliflozin）的C2-OH与氨基酸ASN75和GLU99形成氢键；C3-OH与氨基酸PHE98的主链羰基形成氢键；C4-OH与氨基酸SER287形成氢键；C6-OH与氨基酸GLN457形成氢键[3]，见图2B。

2.3 双靶点抑制剂的生成

本研究构建了基于双向循环神经网络的分子生成模型，模型参数：Bi RNN输出变量（Lstm＿out=192）、学习速率（Learning＿rate=1×10-3）、训练步数（Epoch=100）、样本数量（Batch＿size=140），训练30步后，模型的准确率趋于收敛，准确率可达到90%，见图3。使用MMP方法对部分FDA批准药物进行了拆分，并将骨架碎片导入分子生成模型。在完成去除重复分子后，共生成了7 494个不同的候选化合物分子，用于下一步的虚拟筛选。

表2 DPP-4训练集化合物

表3 SGLT-2训练集化合物

图2 DPP-4晶体结构与alogliptin(A）及SGLT-2晶体结构与empagliflozin(B）的3D结合作用模式

2.4 Hip Hop药效团的构建与验证

为了筛选出潜在的DPP-4和SGLT-2双靶点小分子抑制剂，本研究利用Discovery Studio 3.5中的Hip Hop定性模型方法分别构建了DPP-4抑制剂和SGLT-2抑制剂的药效团模型。构建2个药效团模型选用的训练集分别包含20个小分子化合物，它们具有较好的DPP-4和SGLT-2抑制活性，结构及活性见表2、3。

图3 Bi RNN模型模拟结果

Fig.3 Simulation results of the Bi RNN model

生成的药效团结果参数见表4、5，可知构建的DPP-4药效团模型包含3个特征元素，包括1个氢键受体，1个电荷中心和1个疏水中心；构建的SGLT-2药效团模型包含2个特征元素，包括3个氢键受体和1个疏水中心。

测试集结果验证显示，DPP-4抑制剂的1、8、9号药效团的YA、GH都为100%且EF都为10，见表6,3个药效团模型筛选结果的准确度均较高，且根据热图（图4）对比发现，1号药效团对测试集小分子区分度更强，对阴性化合物和阳性化合物的评判能力更好，因此选择1号药效团用于后续的虚拟筛选。SGLT-2抑制剂的1号药效团是10个药效团中唯一的YA和GH都为100%且EF为10的药效团，见表7、图5，因此选择1号药效团用于后续的虚拟筛选。

表4 DPP-4药效团模型及关键参数

表5 SGLT-2药效团模型及关键参数

表6 DPP-4测试集验证药效团模型结果数据

图4 DPP-4 Ligand Profiler热图

2.5 对接方法验证结果

将共结晶分子的对接构象与原复合物配体构象叠合，并计算其RMSD值以考查复现率（RMSD<2.0Å表明复现率较佳）。结果如图6所示，DPP-4和SGLT-2的对接构象与其原始复合物构象的RMSD值分别为0.396 8、0.515 2Å。

2.6 虚拟筛选结果

利用DPP-4的1号药效团和SGLT-2的1号药效团对Bi RNN模型生成的7 494个小分子分别进行初筛，设置Fit Value>1，取筛选结果的交集共计2 452个小分子。使用Schrödinger软件中的Glide模块将2 452个小分子与DPP-4和SGLT-2分别进行高精度（XP）对接，取打分前2%分别得到49个小分子，对49个小分子取交集得到10个备选小分子，具体结构及对接打分值见表8。

2.7 备选小分子的ADMET预测

使用Discovery Studio 3.5进行备选小分子的ADMET性质预测，结果见表9。

表7 SGLT-2测试集验证药效团模型结果数据

N：测试集总分子数，n：活性分子数，Ht：命中分子数，Ha：命中分子中活性分子数，YA：活性命中率，GH：拟合优度分数，EF：富集因子。

图5 SGLT-2 Ligand Profiler热图

经过ADMET预测发现10个备选小分子均具有良好的水溶性和肠道吸收性，且不能通过血脑屏障，对CYP2D6酶无抑制性，与其他通过CYP2D6酶代谢的药物联用时，不会影响其他药物的代谢过程，不良反应较低。化合物NM68、NM141、NM304这3个化合物存在肝毒性。

2.8 备选小分子可合成性打分SA＿Score以及rdkit QED定量评估类药性

10个备选分子的SA、QED、酯水分配系数（lg P）、氢键供体数目（HBD）、氢键受体数目（HBA）、可旋转键（Rot B）、Mr这些理化性质见表10。SA评分代表小分子合成难易程度，用1～10进行评价，越靠近1表明越容易合成，越靠近10表明合成越困难。QED是一种将药物相似性量化为0～1，用于定量评估药物的类药性，QED的值越高，表示药物越可能具有良好的类药性和生物活性。HBD<5、HBA<10、Rot B≤10、Mr<500类药性较好；lg P<5较好。10个备选小分子均具有较好的可和成性及类药性，均具有一定的开发价值。

图6 DPP-4抑制剂alogliptin(A）和SGLT-2抑制剂empagliflozin(B）的构象叠合图

2.9 分子动力学模拟和结合自由能

RMSD表示某一时刻的构象与目标构象所有原子偏差的加和，是衡量体系是否稳定的重要依据。对10个备选小分子对接复合物体系进行分子动力学模拟。其中DPP-4和SGLT-2与NM186、NM21、NM249、NM107复合物体系的RMSD值随时间变化的结果较为稳定如图7所示，在100 ns的模拟过程中，除了3G0B-NM107这个体系在70 ns后趋于平稳外，其余7个体系均在30 ns后波动逐渐趋于平稳，复合物的RMSD值始终稳定在0.1～0.2 nm，波动较小。RMSF表示蛋白质氨基酸在整个模拟过程中的柔性和运动剧烈程度。如图7所示，除末端区域和低质量区域中的残基外，大多数氨基酸残基的波动范围小于0.4 nm，表明在整个模拟过程中蛋白质的柔性变化在合理区间内。RMSD和RMSF的分析结果显示，在为期100 ns的分子动力学模拟过程中，所有靶蛋白-配体复合物都达到平衡状态，表明4个候选化合物NM186、NM21、NM249、NM107与DPP-4和SGLT-2的结合相对稳定。为充分考虑配体与蛋白结合时的溶剂效应和动态效应等因素，采用MM/PBSA方法计算模拟过程最后10 ns中每一帧的平均结合自由能，进一步比较动态的溶剂环境中4个候选化合物和alogliptin/empagliflozin对DPP-4和SGLT-2的抑制能力。结果如表11所示，4个候选化合物的结合自由能均低于alogliptin/empagliflozin，与分子对接的结果一致。进一步验证了4个候选化合物对DPP-4和SGLT-2的结合能力强。同时，4个候选化合物为结构新颖的未有相关文献报道的新化合物，可视为虚拟筛选研究的命中化合物，作为新型潜在的DPP-4和SGLT-2双靶点抑制剂进行下一步实验研究。

表8 10个备选小分子的结构及结合能

表9 10个备选小分子ADMET性质预测

表1 0 10个备选小分子理化性质分析

2.1 0 候选小分子与受体蛋白的结合模式分析

使用Py Mol软件对上述化合物与受体蛋白的结合作用模式进行逐一分析，如图8所示，NM21、NM107、NM186、NM249 4个候选小分子与DPP-4的关键氨基酸GLU205/206均具有2组氢键相互作用，且距离均小于3.5Å。NM107、NM249与DPP-4的关键氨基酸ARG125也有一组氢键相互作用。4个化合物除了与DPP-4的部分关键氨基酸有相互作用也与其它氨基酸存在着氢键作用，相对较多的相互作用可能是其结合能力比alogliptin更强的有力证据。在SGLT-2的口袋中发现4个小分子与关键氨基酸GLN457和GLU99均具有两组氢键作用，且距离均小于3.5Å，其中NM186和NM107与SGLT-2的关键氨基酸ASN75具有氢键相互作用，NM186和NM249与SGLT-2的关键氨基酸PHE98有氢键相互作用。这些相似的相互作用可能是4个化合与DPP-4和SGLT-2结合能力较强的主要原因。

3、讨论

本研究通过机器学习、虚拟筛选、分子对接和分子动力学模拟方法寻找新型DPP-4/SGLT-2双靶点抑制剂。在构建药效团模型时本研究选择已报道或上市的小分子，并使用已被证实的活性化合物作为验证集去验证药效团模型，保证构建的药效团模型可靠。选用Bi RNN模型，其计算量较小，并且碎片都是来源于真实的分子，预测的分子具有较高的可合成性，模型通过学习已知活性化合物骨架与碎片的结合作用模式预测出具有新型结构的小分子，准确性较高。利用DPP-4和SGLT-2的最优药效团分别去初步筛选Bi RNN模型生成的7 497个小分子并取交集共计得到2 452个小分子。

图7 MD模拟过程中化合物NM21、NM107、NM186、NM249与DPP-4(PDB:3G0B）和SGLT-2(PDB:7VSI）之间的RMSD图及氨基酸的RMSF图

表1 1 4个候选化合物及alogliptin/empagliflozin的结合自由能

研究通过对复合物晶体分子的对接构象与原复合物配体构象进行叠合，并计算RMSD值以表明基于分子对接筛选所得到结果的可靠性，结果表明配体对接构象与共结晶构象几乎完全重合，说明本研究构建的虚拟筛选模型具备可靠性。随后将初筛得到的2 452个小分子进行分子对接，再对对接结果分别取前2%再取交集最终得到10个结合作用模式与现有DPP-4抑制剂alogliptin和SGLT-2抑制剂empagliflozin类似且对接打分较高的小分子。

图8 化合物NM21、NM107、NM186、NM249与DPP-4、SGLT-2之间的相互作用关系图

Fig.8 Interaction between NM21,NM107,NM186,NM24 to DPP-4 and SGLT-2

为了验证上述10个备选小分子复合物体系的稳定性，采用Gromacs进行了100 ns的分子动力学模拟，以分析复合物体系的RMSD及RMSF随时间波动情况，发现化合物NM186、NM21、NM249、NM107复合物体系的RMSD值最终稳定后的幅值始终在0.1～0.2 nm，波动较小。通过RMSF、结合自由能、ADMET以及理化性质分析进一步的印证了化合物NM186、NM21、NM249、NM107可能是潜在的DPP-4/SGLT-2双靶点抑制剂。4个候选化合物作为潜在的新型DPP-4/SGLT-2双靶点抑制剂，为DPP-4/SGLT-2双靶点抑制剂的设计和研发提供了理论指导。

4、结论

本研究构建了用于DPP-4抑制剂和SGLT-2抑制剂筛选的最佳药效团模型。并且采用Bi RNN模型构建了DPP-4/SGLT-2双靶点抑制剂的库共计7 494个小分子。通最佳药效团对这7 494个小分子进行初步筛选并取出交集，再通过分子对接以及分子动力学模拟技术得到具有较高结合稳定性的小分子NM186、NM21、NM249、NM107。

后续将会对这4个化合物进行化学合成以及活性测试，并进行结构优化改造以获得活性更高的DPP-4/SGLT-2双靶点抑制剂，本研究为DPP-4/SGLT-2双靶点抑制剂的开发以及基于Bi RNN及药效团模型的小分子药物的开发提供了参考。

基金资助:陕西省秦创原“科学家+工程师”队伍建设(2023KXJ-080号);

文章来源:孙定康,张鑫磊,郭凯蕾,等.基于BiRNN模型的DPP-4和SGLT-2双靶点抑制剂设计[J].现代药物与临床,2024,39(07):1689-1703.