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JAK/STAT信号通路探讨调控TP53对子宫内膜癌大鼠干预效果

2024-12-13 22 上传者：管理员

摘要：目的基于Janus激酶/信号转导与转录激活因子（JAK/STAT）信号通路探讨调控TP53对子宫内膜癌大鼠的干预效果。方法选取45只SD健康大鼠，随机选取10只大鼠作为对照组，其余35只大鼠用于建模，共建模成功30只大鼠，将其随机分为模型组、下调组、上调组，各10只。对照组和模型组每天给予等量生理盐水，下调组采用TP53 inhibitor慢病毒注射，上调组采用TP53 mimics慢病毒注射，注射24 h后观察变化。结果与对照组相比，模型组、下调组、上调组TP53表达显著下降（P<0.05）;与模型组相比，下调组TP53呈低表达，而上调组TP53呈高表达，差异显著（P<0.05）;与下调组相比，上调组TP53呈显著高表达（P<0.05）,说明转染成功。经干预1、2 w后，与对照组相比，模型组、下调组、上调组肿瘤坏死因子（TNF）-α、白细胞介素（IL）-6、IL-8、C反应蛋白（CRP）、CD8+、JAK、STAT水平均显著升高，CD4+/CD8+、CD4+、CD3+水平均显著降低（P<0.05）;与模型组相比，下调组TNF-α、IL-6、IL-8、CRP、CD8+、细胞增殖率、JAK、STAT水平均显著升高，CD3+、CD4+、CD4+/CD8+水平均显著降低，上调组TNF-α、IL-6、IL-8、CRP、CD8+、细胞增殖率、JAK、STAT水平均显著降低，CD3+、CD4+/CD8+、CD4+水平显著增加（P<0.05）;与下调组相比，上调组TNF-α、IL-6、IL-8、CRP、CD8+、细胞增殖率、JAK、STAT水平均降低，CD3+、CD4+、CD4+/CD8+水平均升高，差异显著（P<0.05）。结论上调TP53可对免疫功能进行调节，有效减轻机体炎症反应，限制细胞增殖，JAK/STAT信号通路被抑制可能与其作用机制有关。

关键词：
免疫功能
子宫内膜癌
炎症反应
细胞增殖
肿瘤蛋白P53
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子宫内膜癌是女性较为常见的生殖系统恶性肿瘤，具有较高的致死率，发病机制尚不清晰，与生活方式、经济工作压力均有关，早期症状不明显，易被患者忽略，以出血、阴道排液、疼痛、腹部包块为主要表现，对患者生命安全构成了严重威胁[1～3]。近年来子宫内膜癌的发病率呈现年轻化趋势，现阶段主要以手术治疗为主，辅以放化疗、激素治疗，存在较大的不良反应不利于患者的恢复，加强早期诊断与检测方法，寻找影响疾病发展的关键分子与相关信号通路，改善预后，遏制病情发展[4～7]。TP53是一种肿瘤抑制基因，可参与基因转录、DNA合成和修复、细胞生长、免疫调节等过程中，在多数肿瘤中会发生突变，影响病情发展[8]。Janus激酶/信号转导与转录激活因子(JAK/STAT)信号通路是一个经典的信号转导途径，参与细胞增殖、存活、转化、迁移等，同时可调节诸多介质和细胞因子，其中STAT可参与炎症因子的细胞信号转导过程，与子宫内膜癌有关[9]。基于此，本研究基于JAK/STAT信号通路探讨TP53对子宫内膜癌大鼠的影响。

1、材料与方法

1.1实验动物

选取45只SD健康大鼠，由九江学院实验动物中心提供，年龄6～8周龄，平均(8.24±0.53)周龄，体质量180～220 g,平均体质量(201.57±16.84)g,饲养温度22～26℃,室内湿度45%～65%,对饲养环境定期进行紫外线消毒处理，保持通风，每日进行光照12 h,提供正常饮水饮食，持续1 w饲养，医院伦理委员会已批准本次研究。

1.2分组与建模

选取45只SD大鼠，随机选中10只大鼠作为对照组，不做任何处理，其余35只大鼠均用于子宫内膜癌构建。

首先购买Ishikawa肿瘤细胞(深圳市豪地华拓生物科技有限公司),接种于10%胎牛血清培养基，在5%CO2、37℃孵育箱培养，当生长达瓶底75%～85%时，丢弃培养液，使用磷酸盐缓冲液(PBS)冲洗3次，再借助0.25%胰蛋白酶消化处理，后收集细胞进行离心处理(1 100 r/min)5 min,制成5×105个/ml的细胞悬液备用。将细胞悬液按0.4 ml注射在大鼠右侧肩胛背部，连续注射2 w。观察其背部有无肿瘤形成，成瘤标准为接种位置出现肿瘤小结节或有可触及小结节，共建模成功30只，随机分为模型组、下调组、上调组各10只。

1.3 TP53转染

每日给予对照组及模型组等量生理盐水，给予下调组8μl TP53 inhibitor慢病毒进行注射转染，给予上调组8μl TP53 mimics慢病毒进行注射转染，待注射24 h之后，观察大鼠情况是否发生变化。

1.4样本采集

采集大鼠经TP53转染后的7 ml静脉血，离心处理，吸取上清液，将其置于-20℃进行保存。于2 w后处死大鼠，将其子宫内膜组织放置于-80℃冰箱中，等待检验。

1.5 TP53转染效率鉴定

取大鼠经TP53转染后的子宫内膜组织，利用逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)法对其转染效率进行鉴定，提取总RNA,取逆转录试剂盒将大鼠RNA进行反转录，形成cDNA,利用Primer5.0软件对GAPDH、TP53引物序列进行设计，将PCR仪开启，其反应体系为上下游引物各0.5μl、cDNA(20 ng/μl)模板、10μl 2×SYBRMix,加至20μl蒸馏水。其反应条件为：5 min 95℃;10 s 95℃,30 s 60℃,205 s 72℃,进行循环40个，利用2-△△Ct方法对TP53表达量进行计算。TP53上游引物序列：5′-TTCCTCCAACACAAACACGAGA-3′,下游：5′-GCTCAGTAGGTGACTCTTCTCACT-3′。本次实验所使用的试剂盒均由上海羽哚生物科技有限公司提供。

1.6苏木素-伊红(HE)染色处理

取大鼠子宫内膜组织，于10%多聚甲醛进行浸泡，随后进行12 h固定，利用常规石蜡包埋及4～5μm厚度石蜡切片的制作，取苏木素-伊红进行染色处理，将其置于显微镜下，对大鼠子宫内膜组织病理变化进行观察。

1.7炎性因子、免疫功能指标检测

采用酶联免疫吸附试验(ELISA)进行测定，检测步骤应按照说明书进行，其步骤为：取磷盐酸缓冲液对抗体进行稀释，将其稀释至适合浓度，取稀释后抗体0.1 ml加入反应孔中，置于4℃冰箱中过夜保存，于次日将其舍去，反复进行3次洗涤，加稀释样品，封存后进行温育(37℃/60 min),加酶标抗体(37℃/30 min),洗涤。取0.1 ml四甲基联苯胺(TMB)底物液，加入反应孔中，使其显色，等待15 min,随后加入0.05 ml终止液，放置于白色背景，测定并观察各孔吸光值，进而得出肿瘤坏死因子(TNF)-α、白细胞介素(IL)-6、IL-8、CRP水平采用流式细胞仪对大鼠的CD3+、CD4+、CD8+水平进行检测，计算CD4+/CD8+,并比较其变化，仪器购自华侠(深圳)健康医疗科技有限公司，

1.8细胞增殖检测

采用MTT比色法进行测定，将子宫内膜细胞接种于6孔板，每孔5×103个细胞，分别加入细胞悬浮液100μl,放于37℃、含有CO2的培养箱培养48 h,加MTT 15μl,孵育3 h,弃孔上清，离心处理取孔上清，加入二甲基亚砜(DMSO),充分溶解晶体，使用酶标仪检测光密度(OD)值。细胞增殖率=(转染组OD值/空白组OD值)×100%。

1.9肝癌缺失基因(DLC)1蛋白表达检测

利用Western印迹检测DLC1蛋白表达，取子宫内膜组织0.5 g,进行剪碎处理，取组织裂解液600μl,进行离心处理，离心转速为12 000 r/min,离心6 min,吸取上清液，利用二喹啉甲酸(BCA)方法对蛋白浓度进行检测。提取各个样品中蛋白15μg,采取聚丙烯酰胺凝胶电泳处理，转入聚偏氟乙烯(PVDF)膜，于常温进行90 min密封，加一抗，于4℃过夜孵育。次日取出后进行冲洗，加二抗，等待60 min后，进行洗涤显色处理，测定DLC1水平。

1.10统计学处理

采用SPSS19.0软件进行方差齐性检验、重复测量的方差分析。

2、结果

2.1各组病理组织学

如图1所示，对照组细胞结构清晰，形态正常，排列有序且整齐；模型组细胞排列杂乱，明显肿胀，有炎性细胞浸润；下调组细胞排列紊乱，肿胀变严重，出现坏死，炎性细胞变多；上调组排列较为有序，肿胀改善，炎性细胞浸润现象减轻。

图1各组子宫病理组织学(HE染色，×200)

2.2 TP53转染效率鉴定

如表1所示，模型组、下调组、上调组TP53表达量较对照组降低，差异显著(P<0.05);下调组TP53表达量较模型组下降，上调组TP53表达量较模型组升高，差异显著(P<0.05);上调组TP53表达量显著高于下调组(P<0.05),提示成功转染。

2.3各组炎性因子指标对比

如表1所示，干预1、2 w后，模型组、下调组、上调组TNF-α、IL-6、IL-8、CRP水平显著高于对照组(P<0.05);下调组上述指标高于模型组，上调组上述指标低于模型组；上调组上述指标低于下调组，具有统计学差异(P<0.05)。

表1各组TP53转染效率鉴定及炎性因子指标对比

2.4各组免疫功能指标对比

如表2所示，干预1、2 w后，与对照组相比，模型组、下调组、上调组CD3+、CD4+、CD4+/CD8+水平下降，CD8+水平上升；下调组CD3+、CD4+、CD4+/CD8+水平低于模型组，但CD8+水平升高，而上调组CD3+、CD4+、CD4+/CD8+水平高于模型组，但CD8+水平下降；上调组CD3+、CD4+、CD4+/CD8+水平高于下调组，但CD8+水平下降，具有统计学差异(均P<0.05)。

表2各组免疫功能指标对比

2.5各组细胞增殖情况对比

如表3所示，干预1、2 w后，下调组细胞增殖率高于模型组，上调组细胞增率低于模型组；上调组细胞增殖率低于下调组，均具有统计学差异(均P<0.05)。

表3各组细胞增殖率对比

2.6各组JAK/STAT信号通路蛋白表达量对比

如表4、图2所示，模型组、下调组、上调组JAK、STAT蛋白表达量高于对照组；下调组上述指标高于模型组，上调组上述指标低于模型组；上调组上述指标低于下调组，均具有统计学差异(均P<0.05)。

表4各组JAK/STAT信号通路蛋白表达量对比

图2 Western印迹检测各组JAK/STAT信号通路蛋白

3、讨论

研究显示，炎症因子可对肿瘤微环境产生影响，较高水平会促进子宫内膜癌发展[10,11]。TNF-α、IL-6、IL-8、CRP是炎症反应的常用指标，与多种肿瘤疾病有关，其水平升高会加剧机体的炎症反应，使病情进一步恶化[12,13]。本研究发现，上调TP53可使TNF-α、IL-6、IL-8、CRP水平降低，抑制炎症因子的释放。相关研究学者发现，近年来炎症因子在肿瘤微环境的研究增多，子宫内膜癌发生致使TNF-α水平升高，可起到保护作用，但长期处于高水平状态易对正常组织造成损伤，不利于病情的恢复，IL-6能够调节机体炎症，促进恶性肿瘤发展，IL-8对血管生成具有促进作用，进而增加肿瘤细胞的致瘤性、转移性和侵袭性，而CRP升高会不利于患者预后[14,15]。靶向上调TP53表达可对机体炎症减轻起到积极作用，减少炎症因子的释放[16]。该研究与本研究保持一致，表明上调TP53可减轻机体的炎症反应，促进病症的好转。

免疫系统和子宫内膜癌具有密切的联系，免疫功能的降低对肿瘤生长起到促进作用，加重病情[17]。T淋巴细胞是免疫系统的重要组成部分，CD3+、CD4+、CD4+/CD8+、CD8+水平变化能够体现机体的免疫功能状态[18,19]。本研究发现，上调TP53可使CD3+、CD4+、CD4+/CD8+升高，CD8+水平降低，改善机体的免疫力。相关学者研究发现，子宫内膜癌的发生会使CD3+、CD4+、CD4+/CD8+降低，CD8+水平升高，导致免疫功能发生紊乱，减弱了机体的抗肿瘤能力，不利于抑制肿瘤细胞的生长，此外TP53对免疫功能具有调节作用[20,21];与本研究较为一致，表明上调TP53可改善免疫功能，阻碍病情的发展。

JAK/STAT信号通路与细胞生长状态有关，激活后会造成细胞异常增殖，增强恶性转化[22]。该通路可参与炎症反应，许多炎症细胞因子通过上调该信号加重炎症反应，不利于病情的恢复[23]。本研究发现，上调TP53能够使JAK、STAT表达量降低，降低细胞增殖速度。相关研究显示，JAK/STAT信号通路与肿瘤细胞生长、增殖、分化有关，可调节免疫、炎症、肿瘤等病理生理过程，JAK是一种蛋白酪氨酸激酶，而STAT存在于多细胞机体，其中的STAT3被激活与肿瘤发生、发展有关，对肿瘤细胞有较好的促生长与抗凋亡作用，阻断JAK/STAT信号通路可抑制肿瘤细胞的生长和诱导凋亡，是肿瘤治疗的一个新靶位，在子宫内膜癌呈高表达，可促进病情发展[24,25]。该研究与本研究一致，表明上调TP53可抑制JAK/STAT信号通路，对降低细胞增殖率起到较为积极的作用。

综上，TP53可抑制子宫内膜癌发展，干预后子宫内膜癌大鼠的炎性反应明显减轻，增强免疫功能，其作用机制可能与JAK/STAT信号通路相关。

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