子宫内膜腺癌是女性中第六大常见癌症，是一种发生在子宫内膜的上皮恶性肿瘤[1],临床表现为不规则阴道出血、腹胀、疼痛等[2-3]。2020年，全球有41.7万例新确诊的子宫内膜腺癌患者，其发病率在全球范围内呈上升趋势[4-5]。在过去30年中，子宫内膜腺癌总发病率上升了132%,其风险因素主要是肥胖和人口老龄化[6]。有研究表明，在20种最常见的肿瘤类型中，子宫内膜腺癌与肥胖的关系最为密切，患者体重指数(BMI)每增加5 kg/m2,患癌症的风险就会增加54%[7],且BMI大于40 kg/m2的女性患子宫内膜腺癌的风险为10%～15%[8]。

在许多发展中国家和发达国家中，超重和肥胖的流行率急剧增加，在女性群体中更是普遍。研究发现，全世界育龄妇女的肥胖率正在上升，预计到2025年全世界将有20%的肥胖妇女[9]。相关研究发现，肥胖造成了一种促炎环境，即以高循环水平的C反应蛋白、白细胞介素-6和肿瘤坏死因子-α为主的促炎环境，该促炎环境可能是肥胖增加子宫内膜腺癌风险的机制[10]。随着肥胖率的增加，子宫内膜腺癌的临床诊断和治疗也越来越具有挑战。因此，需要更多的研究来为高危妇女提供初级预防，并优化子宫内膜腺癌患者生存率。

近年来，微阵列和高通量测序等研究方法被应用于探究癌症生物标志物，一些癌症标志物被应用于癌症的诊断、治疗和预后[11]。目前，有研究基于癌症基因组图谱(TCGA)数据库筛选出与子宫内膜腺癌相关的糖酵解途径上的B3GALT6、DCN等9个基因[12]。然而，与肥胖相关的子宫内膜腺癌的标志基因还没有被完全了解。因此，本研究基于TCGA数据库的子宫内膜腺癌或腺瘤的基因表达数据和基因表达综合(GEO)数据库的肥胖数据集GSE12050,利用DESeq和edgeR筛选差异基因，随后进行基因本体(GO)功能分析、京都基因与基因组百科全书(KEGG)通路富集分析和蛋白质-蛋白质相互作用(PPI)网络分析等生物信息学分析方法，发现与肥胖相关子宫内膜腺癌诊断和预后的相关指标，为肥胖相关子宫内膜腺癌的防治提供理论依据。

1、资料与方法

1.1 数据来源

在TCGA数据库(GDC1.0版本)中检索407例子宫内膜腺瘤或腺癌患者的基因表达数据，检索关键词为“corpus uteri, TCGA-UCEC,adenomas and adenocarcinomas, transcriptome profiling, Gene Expression Quantification”。在GEO数据库中检索肥胖基因表达数据集GSE12050,检索关键词为“obesity, female”。

1.2 方法

1.2.1基因差异表达分析

为了识别子宫内膜腺癌和对照组，以及肥胖(BMI>30 kg/m2)和对照组(BMI<25 kg/m2)的差异基因，采用R语言的limma包[13]和edgeR包[14]分别对2组数据进行基因差异表达分析，采用pheatmap包和ggplot2包绘制差异基因热图和火山图。采用本杰明-霍赫伯格方法调整原始P值，以控制错误发现率(FDR)。子宫内膜腺癌差异基因筛选标准为|logFC|≥1和adj.P<0.05,肥胖差异基因筛选标准为|logFC|≥0.585和adj.P<0.05。

1.2.2肥胖相关子宫内膜腺癌的差异基因鉴定和GO功能、KEGG通路富集分析

采用R语言的VennDiagram包[15]将子宫内膜腺癌和肥胖症中表达上调的差异基因重叠，表达下调的差异基因重叠，获得肥胖相关子宫内膜腺癌表达上调和下调的差异基因。采用R语言clusterProfiler包[16]对筛选的核心基因进行GO功能富集分析和KEGG通路富集分析，条件为P<0.05。

1.2.3肥胖相关子宫内膜腺癌关键基因鉴定及关键基因MANIA网络分析

采用STRING数据库构建差异基因的PPI网络，利用Cytoscape的插件cytoHubba[17]计算Degree值，找到网络中的关键基因。在Gene MANIA数据库中对关键基因进行MANIA网络分析。Gene MANIA数据库用于生成有关基因功能的假设、分析基因列表和确定基因的优先级[18]。

1.2.4关键基因相关性分析和受试者工作特征(ROC）曲线分析

利用子宫内膜腺癌数据集验证关键基因在不同分级阶段子宫内膜腺癌中的表达水平。根据TCGA分级标准将子宫内膜腺癌患者分为3级(G1、G2和G3),使用R语言的limma、ggpubr包将不同阶段关键基因的表达水平绘制成盒状图。采用R语言的timeROC包[19]分析关键基因ROC曲线。

1.2.5泛癌差异分析

TIMER2.0是肿瘤免疫相关数据库，使用6种最先进的算法，为TCGA或用户提供的肿瘤概况提供更可靠的免疫浸润水平估计[20]。采用TIMER2.0对关键基因进行泛癌差异分析，分析关键基因在正常组织和多种癌症组织中的表达情况。

1.2.6关键基因与肿瘤微环境的相关性分析

肿瘤微环境中有很多细胞，包括肿瘤细胞、成纤维细胞、血管内皮细胞、免疫细胞、可溶性蛋白甚至囊泡和细胞外基质等，肿瘤微环境显著影响着肿瘤的诊断、生存结局和临床治疗敏感性。肿瘤免疫单细胞中心(TISCH2)是专注于肿瘤微环境的单细胞RNA测序数据库。TISCH2数据库在单细胞水平方面提供详细的细胞类型注释，使不同肿瘤类型的肿瘤微环境得以被探索。本研究应用TISCH2开放获取工具[21]在单细胞水平上评估关键基因和肿瘤免疫微环境特征之间的联系，分析参数为Gene: DBI;Cell-type annotation: Cell type(major-lineage);Cancer type: UCEC(Uterine Corpus Endometrial Carcinoma);Cell type included in datasets: No parameter set; Lineage for calculating correlation: All lineage; Treatment: No treatment; Primary/Metastatic: Primary。

1.2.7关键基因相关蛋白在子宫内膜腺癌和癌旁组织中的丰度表达差异分析

CPTAC数据库可查看和分析不同肿瘤类型中的基因表达情况和基因在不同肿瘤类型中的表达情况，发现潜在的标志物或靶点。通过该数据库访问蛋白组数据，利用cProSite工具分析关键基因相关蛋白在子宫内膜腺癌和癌旁组织中的丰度差异。该工具侧重于肿瘤和正常组织中不同蛋白质和mRNA之间的比较和相关性分析。分析条件为Tumor Types: Uterine Cancer; Dataset: Relative Protein Abundance; Analysis: Tumor vs Nomal Tissue; Gene: DBI。

1.3 统计学处理

采用R4.3.0软件、cytoscape3.10.1软件进行统计学分析。计数资料以例数或百分比表示；计量资料以

表示，组间比较采用t检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2、结果

2.1 基因差异表达分析结果

对TCGA数据库中子宫内膜腺癌基因表达数据进行基因差异表达分析，获得差异基因5 479个，包括2 823个表达下调基因和2 656个表达上调基因(图1A、B)。对GSE12050数据集中肥胖基因表达数据进行差异分析，获得差异基因171个，包括68个表达下调基因和103个表达上调基因(图1C、D)。

2.2 差异基因鉴定和功能、通路富集分析结果

将子宫内膜腺癌和肥胖症中表达下调的差异基因重叠，获得14个交集基因(图2A);将子宫内膜腺癌和肥胖症中表达上调的差异基因重叠，获得19个交集基因(图2B)。对肥胖相关子宫内膜腺癌的33个差异基因进行GO功能富集分析，结果显示，差异基因主要涉及NADP代谢过程、含胶原蛋白的细胞外基质和内肽酶活力等功能(图2C)。KEGG通路富集分析显示，差异基因主要涉及谷胱甘肽代谢、碳代谢和戊糖磷酸等途径(图2D)。

2.3 关键基因筛选和MANIA网络分析结果

利用STRING构建肥胖相关子宫内膜腺癌差异基因的PPI网络，于cytoscape进行可视化，表达上调和下调的差异基因见图3A。基于cytoscape中的cytoHubba插件计算基因的Degree值，并取前10个基因(COL11A1、LOXL2、SFRP1、IDH1、FMO2、PGD、DBI、EGFL6、NRCAM、TALDQ1)作为关键基因(图3B),其中COL11A1、LOXL2、IDH1、PGD、DBI、EGFL6、NRCAM7个基因表达上调，其余3个基因表达下调。关键基因MANIA网络分析显示，肥胖相关子宫内膜腺癌关键基因涉及NADP代谢过程、蛋白质氧化、氧化还原酶活等功能(图3C)。

图1子宫内膜腺癌和肥胖基因差异表达分析

图2肥胖相关子宫内膜腺癌差异基因鉴定及功能通路富集分析

图3肥胖相关子宫内膜腺癌的关键基因鉴定和关键基因MANIA网络分析

2.4 关键基因相关性分析和ROC曲线分析结果

COL11A1、DBI、EGFL6基因表达量随癌症分级增加而增加(P<0.05),SFRP1、FMO2表达量随癌症分级增加而减少(P<0.05)。ROC曲线显示，COL11A1和DBI更能准确预测子宫内膜腺癌患者的5年生存率。见图4、5。

图4肥胖相关子宫内膜腺癌的关键基因相关性分析

图5肥胖相关子宫内膜腺癌的核心基因ROC曲线分析

2.5 泛癌差异分析结果

相对于正常组织，COL11A1基因在多种癌症组织中的表达量更高，如子宫内膜腺癌、膀胱尿路上皮癌和乳腺浸润癌等(图6A)。相对于正常组织，DBI基因在多种癌症组织中的表达量更高，如子宫内膜腺癌、膀胱尿路上皮癌和多形成性胶质细胞瘤等(图6B)。

图6泛癌差异分析

2.6 关键基因与肿瘤微环境的相关性分析结果

DBI在基质细胞和免疫细胞中有不同的表达水平(图7A)。在UCEC-GSE139555数据集中，DBI在T细胞和成纤维细胞中表达(图7B)。在UCEC-GSE154763数据集中，DBI在肥大细胞、树突状细胞、单核细胞-巨噬细胞和浆细胞样树突细胞中表达(图7C)。

图7TISCH2数据库DBI与肿瘤微环境在单细胞水平上的相关性

2.7 关键基因相关蛋白在子宫内膜腺癌和癌旁组织中的丰度表达差异分析结果

子宫内膜腺癌组织DBI相关蛋白丰度表达量高于癌旁组织，差异有统计学意义(P<0.01)。子宫内膜腺癌组织DBI基因表达量高于癌旁组织，差异有统计学意义(P<0.01)。见图8。

图8DBI相关蛋白在子宫内膜腺癌组织和癌旁组织中的丰度表达差异分析

3、讨论

子宫内膜腺癌发病率在全球范围内呈上升趋势。目前，国内外研究学者对子宫内膜腺癌的发病机制尚未完全探索清楚。国内研究显示，肥胖、年龄、绝经情况、淋巴结浸润等因素与子宫内膜腺癌患者预后有关[22-23]。国外研究显示，肥胖，代谢，生殖因素和遗传因素是子宫内膜腺癌的风险因素[24]。临床上，肥胖伴子宫内膜腺癌患者预后比非肥胖患者差[25],因此，鉴定肥胖相关子宫内膜腺癌的生物标志物对于筛查高危女性、对子宫内膜腺癌患者进行风险分层、制定个体化治疗方案及评估预后非常有价值。本研究基于TCGA数据库和GEO数据库的人群数据集筛选肥胖相关子宫内膜腺癌的差异基因和关键基因，对关键基因进行功能、通路富集分析，并从临床预后、肿瘤微环境和蛋白质组学方面分析关键基因的预后意义，结果提示，COL11A1、DBI基因在子宫内膜腺癌尤其是与肥胖相关的子宫内膜腺癌中发挥着重要作用。

COL11A1基因是Ⅺ型胶原蛋白alpha1链编码基因，其在子宫内膜腺癌中的相关研究较少见。在其他癌症中，COL11A1阳性免疫染色在乳腺癌、结肠癌、膀胱癌和卵巢癌的小活检组织中可作为肿瘤浸润的准确预测指标[26]。在乳腺癌、结直肠癌和胰腺癌中，COL11A1表达呈进行性增加[27]。COL11A1主要由癌症相关成纤维细胞亚群表达和分泌，可调节肿瘤代谢表型来促进癌细胞迁移和转型[28]。本研究对肥胖相关子宫内膜腺癌关键基因的GO功能、KEGG富集分析显示，COL11A1基因可能通过参与NADP代谢和谷胱甘肽代谢等多种代谢途径影响肥胖伴子宫内膜腺癌的发生、发展。本研究在TISCH2数据库中对该基因进行分析，结果提示“No significant correlated genens”,这说明COL11A1基因与子宫内膜腺癌微环境相关检验P>0.05或绝对相关系数小于0.2。基于CPTAC数据库对COL11A1基因相关蛋白在子宫内膜腺癌组织和癌旁组织中的丰度表达差异进行分析，结果提示“No data available”。这说明COL11A1在子宫内膜腺癌中的蛋白组学和作用机制有待深入研究。DBI基因编码地西泮结合抑制因子。研究发现，肥胖个体的酰基辅酶A结合蛋白(ACBP)/DBI水平异常高，与肥胖人群的脐周脂肪表达高水平的ACBP/DBI mRNA有关[29],DBI/ACBP定位于细胞内时参与调节脂肪酸代谢，而在细胞外则扮演地西泮结合蛋白的角色[30],DBI/ACBP可能在BMI中起重要作用[31]。本研究结果显示，DBI在子宫内膜腺癌的免疫细胞和基质细胞中高表达，基于CPTAC数据库的分析也显示该基因相关蛋白在子宫内膜腺癌中高表达，提示DBI与肿瘤微环境密切相关，并可能通过多种细胞及调控相关蛋白对肿瘤发生、发展产生影响，也可能通过调节脂肪酸代谢等途径影响肥胖相关子宫内膜腺癌发生、发展。

综上所述，肥胖相关子宫内膜腺癌发生、发展相关的基因为COL11A1、DBI、EGFL6、SFRP1、FMO2基因，其中COL11A1、DBI基因在子宫内膜腺癌尤其是与肥胖相关的子宫内膜腺癌中发挥着重要作用，其可通过参与脂肪酸代谢、NADP代谢等多种代谢途径对肥胖相关子宫内膜腺癌发生、发展产生影响。COL11A1、DBI基因或许可作为肥胖相关子宫内膜腺癌早期诊断、精准治疗、预测预后的指标。

参考文献:

[22]周远利,李丹青,杨英捷.Ⅰ型子宫内膜腺癌预后的影响因素分析[J].贵州医科大学学报,2023,48(9):1088-1091.

[23]莫紫文,李培源,张应亮.影响子宫内膜腺癌患者复发的高危因素及预防措施探讨[J/CD].现代医学与健康研究电子杂志,2023,7(17):102-105.

基金资助:重庆市自然科学基金面上项目(cstc2020jcyj-msxmX0041);

文章来源:杨春雪,谭丽萍,陈义凤,等.肥胖相关子宫内膜腺癌关键基因筛选研究[J].现代医药卫生,2024,40(21):3615-3624.