首页 > 论文范文 > 医药卫生论文 > 肿瘤科论文 > 肿瘤实验研究论文 > lncRNA FEZF1-AS1促进黑色素瘤细胞增殖和侵袭的实验研究

lncRNA FEZF1-AS1促进黑色素瘤细胞增殖和侵袭的实验研究

2024-09-10 78 上传者：管理员

摘要：目的:观察lncRNA FEZF1-AS1对黑色素瘤细胞增殖和侵袭的影响。方法:对黑色素瘤病人的肿瘤组织和癌旁组织进行lncRNA测序分析，以肿瘤组织表达增加最明显的lncRNA FEZF1-AS1作为研究对象。通过转染慢病毒载体沉默黑色素瘤细胞A375中lncRNA FEZF1-AS1的表达。利用流式细胞术和qRT-PCR验证转染效果。通过CCK-8和Transwell实验检测A375细胞的增殖水平和侵袭能力。将敲减lncRNA FEZF1-AS1前后的A375细胞皮下注射到小鼠体内，检测移植瘤体积、质量以及生存时间。Western blot检测敲减lncRNA FEZF1-AS1前后A375细胞中Notch1的表达水平。结果:相比癌旁组织，黑色素瘤组织中lncRNA FEZF1-AS1的表达显著增高。通过转染慢病毒敲减，A375细胞中lncRNA FEZF1-AS1的表达明显降低。沉默lncRNA FEZF1-AS1后，A375细胞的增殖率降低，侵袭能力下降。敲减lncRNA FEZF1-AS1后，黑色素瘤模型小鼠肿瘤体积减小，质量降低，生存时间明显延长。沉默lncRNA FEZF1-AS1后细胞中Notch1蛋白表达降低。结论:lncRNA FEZF1-AS1能够增强黑色素瘤细胞A375的增殖和侵袭，这种作用与lncRNA FEZF1-AS1增强Notch1信号通路相关。

关键词：
LncRNA FEZF1-AS1
侵袭
增殖
黑色素瘤
黑色素细胞
加入收藏

黑色素瘤是一种黑色素细胞来源的恶性程度较高的肿瘤，好发于皮肤，也可见于胃肠道等器官组织中[1]。近年来，我国的黑色素瘤发病率呈增加的态势，与其他实体瘤相比，其致死年龄更低，具有侵袭性高、恶化程度高、治疗难度大等特点[2]。除了早期手术切除外，对于恶性黑色素瘤缺乏特效治疗，预后较差，所以恶性黑色素瘤的早期诊断和治疗极其重要[3]。近年来，对于黑色素瘤相关生物标志物的探索，越来越受到研究人员的关注。

长链非编码RNA(long non-coding RNA,lncRNA)在肿瘤发生发展的过程中发挥重要作用，可以对肿瘤细胞的增殖、迁移、侵袭等方面发挥调控作用[4]。肿瘤样本的全基因组关联研究发现了大量与各类癌症相关的lncRNA。但是lncRNA在黑色素瘤中的作用还有待研究，所以我们利用lncRNA测序技术对黑色素瘤病人癌组织和癌旁组织进行了检测，将差异表达最明显的lncRNA FEZF1-AS1作为研究对象，并且研究了lncRNA FEZF1-AS1对黑色素瘤A375细胞增殖和侵袭的作用。Notch信号通路参与多种肿瘤微环境的调节以及肿瘤细胞的生长[5]。然而，lncRNA FEZF1-AS1对黑色素瘤细胞的作用以及lncRNA FEZF1-AS1是否影响Notch1信号通路仍然不清楚，本研究有望为黑色素瘤的诊断和治疗提供新的靶点。

1、材料与方法

1.1实验动物与试剂材料

BALB/C裸鼠购于常州卡文斯实验动物中心，实验小鼠为6～8周的雄性小鼠。人黑色素瘤细胞A375购于上海生物化学研究所。DMEM、1640培养液，胎牛血清购于美国Gibco公司；CCK-8购于上海碧云天生物有限公司；多功能培养箱购于上海力康公司；流式细胞仪购于美国贝克曼库尔特公司；定量检测仪器购于美国GE公司；羊抗小鼠GAPDH、Notch1抗体购于英国Abcam公司。

1.2小鼠黑色素瘤荷瘤小鼠模型的构建

用含有10%胎牛血清的DMEM培养基在5% CO2培养箱中培养A375小鼠黑色素瘤细胞，在肿瘤细胞对数生长期，并且长满培养皿底的80%,胰酶消化细胞，将细胞冲洗下来，按每只小鼠2×106个A375细胞皮下注射到BALB/C裸鼠右侧背部，构建黑色素瘤荷瘤小鼠模型。本实验涉及的动物实验符合伦理委员会所制定的伦理学标准。

1.3组织样本采集

样本来自镇江市第一人民医院2021年01月到2022年06月确诊的10例黑色素瘤患者。所有参与人员签署知情同意书，并了解研究的细节。

1.4 lncRNA测序

提取到肿瘤组织和癌旁组织样本后，剪碎组织，TRIZOL溶解，标本的lncRNA测序委托广东基迪奥公司进行检测分析。

1.5 qRT-PCR检测

组织或细胞的样本均溶于TRIZOL试剂中，手工法提取总RNA。逆转录获得cDNA,保存于4℃冰箱备用。根据日本Takara公司的试剂盒说明书，对标本进行lncRNA的定量检测，其中预变性温度为98℃,延伸的温度为60℃,变性延伸退火设置40个循环，内参基因选择GAPDH。最终通过Ct值计算lncRNA的相对表达量。

1.6慢病毒载体的制备与转染

lncRNA FEZF1-AS1慢病毒载体由上海吉凯公司设计完成，选择pHBLV-U6-PGK-Puro作为质粒的载体。经过基因测序证明了载体的克隆切入点以及编号(EN-ST-00000004829)。在细胞生长状态良好时，按照1∶5的比例转染细胞，以GFP作为慢病毒荧光探针，通过流式细胞仪检测慢病毒的转染效率。

1.7 CCK-8实验检测细胞的增殖

收集不同组别的黑色素瘤细胞，按照5 000个/100μL的浓度接种到96孔板中，按照上海碧云天CCK-8检测试剂盒的操作说明，在72 h后加入CCK-8试剂，37℃孵育2 h,用酶标仪在450 nm处测定吸光度，每个标本设置3个复孔。

1.8 Transwell小室实验检测细胞的迁移

收集不同组别黑色素瘤细胞，按照1∶3的比例配置上室的凝胶液体，并用于包被上室，37℃孵育2 h。上室加不含血清的培养液，下室加含有10%胎牛血清的DMEM培养基。37℃培养24 h后用结晶紫染色，显微镜下拍照并进行细胞计数。每组细胞重复实验3次。

1.9荷瘤小鼠体内实验

每组设置6只小鼠，荷瘤小鼠的肿瘤大小由游标卡尺进行测量并计算。肿瘤的长度为a,宽度为b,肿瘤的体积计算公式为1/2(a×b)2。肿瘤体积超过50 mm3表示荷瘤小鼠建模成功。

1.10统计学处理

数据以表示，用t检验比较各组的差异，P<0.05为差异有统计学意义；对各组的均数差异分析选用单因素方差分析；用Kaplan-Meier法分析荷瘤小鼠的生存期，P<0.05为差异有统计学意义。

2、结果

2.1黑色素瘤患者组织的lncRNA测序分析及验证

首先，对收集的10例黑色素瘤患者的肿瘤组织和癌旁组织样本，其中男5例，女5例，年龄(64.5±12.8)岁，进行了lncRNA测序分析(图1A),结果显示相比于癌旁组织，肿瘤组织中lncRNA FEZF1-AS1、DANCR、POU3F3、HOXD-AS1、BASP1-AS1、SNHG12、MEG3、LINC00662、CASC2、CCAT1表达显著增加，列在前十位(图1B)。接下来通过qRT-PCR对测序结果进行验证，结果显示癌组织中的lncRNA FEZF1-AS1明显高于癌旁组织(图1C)。对人黑色素瘤细胞株SK-MEL-28、A357、A2058和CHL-1中的lncRNA FEZF1-AS1进行了检测，如图1D所示，相比正常人皮肤细胞HEMa-LP,黑色素瘤细胞株SK-MEL-28、A357、A2058和CHL-1中lncRNA FEZF1-AS1的表达明显增高(图1D)。由于在黑色素瘤细胞株中，A357中lncRNA FEZF1-AS1的表达最高，所以后续使用A357细胞进行体外的生物学实验。

图1黑色素瘤组织的lncRNA测序

2.2 lncRNA FEZF1-AS1的敲减和鉴定

利用慢病毒载体敲减A375细胞中的lncRNA FEZF1-AS1。转染的载体设计带有GFP荧光探针，通过流式细胞术检测，结果表明转染后的A375细胞中超过90%的细胞显示GFP阳性，表明慢病毒转染成功(图2A)。qRT-PCR检测转染后的A375细胞，结果显示相比阴性对照组，慢病毒转染的A375细胞中lncRNA FEZF1-AS1的表达明显降低(图2B)。

2.3 lncRNA FEZF1-AS1促进A375细胞的增殖

利用CCK-8分别在24、48、72和96小时对各个组别A375细胞的增殖率进行检测，结果表明在细胞培养48、72和96小时，敲减lncRNA FEZF1-AS1的A375细胞增殖率明显降低(图3)。这些结果表明lncRNA FEZF1-AS1能够增强黑色素瘤细胞的增殖水平。

2.4 lncRNA FEZF1-AS1促进黑色素瘤细胞的侵袭

通过Transwell实验检测各组A375细胞的侵袭能力。结果表明，敲减lncRNA FEZF1-AS1后，转穿透分子筛的A375细胞数量明显降低(图4A,B)。这些结果表明lncRNA FEZF1-AS1能够增强黑色素瘤细胞的侵袭能力。

图2 lncRNA FEZF1-AS1的沉默与鉴定

图3 lncRNA FEZF1-AS1促进黑色素瘤细胞的增殖(*P<0.05,***P<0.001)

2.5 lncRNA FEZF1-AS1促进黑色素瘤模型小鼠肿瘤的生长

通过敲减lncRNA FEZF1-AS1前后的A375细胞进行移植瘤小鼠模型的构建。在小鼠模型发展过程中，对肿瘤的体积、重量和生存率进行了记录。结果表明，敲减lncRNA FEZF1-AS1后，小鼠肿瘤的体积和重量均显著小于阴性对照组(图5A、B、C)。利用Kaplan-Meier分析移植小鼠的生存期，结果表明敲减lncRNA FEZF1-AS1后，黑色素瘤小鼠模型的生存期明显增高(中位生存期：48 d vs 34 d,P<0.05,图5D)。

2.6 lncRNA FEZF1-AS1增强黑色素瘤细胞中的Notch1信号通路

我们推测lncRNA FEZF1-AS1是否对黑色素瘤细胞中的Notch1信号产生影响。结果表明，与阴性对照组比较，沉默lncRNA FEZF1-AS1后黑色素瘤细胞中Notch1蛋白表达水平明显降低(图6)。这些结果表明lncRNA FEZF1-AS1可以激活黑色素瘤A375细胞中的Notch1信号通路，提示lncRNA FEZF1-AS1可能通过Notch1信号通路调节黑色素瘤细胞的生物学行为。

图4 lncRNA FEZF1-AS1促进黑色素瘤细胞的侵袭

图5 lncRNA FEZF1-AS1促进黑色素瘤模型小鼠肿瘤的进展

图6 lncRNA FEZF1-AS1增强Notch1信号通路

3、讨论

lncRNA在多种类型的癌细胞中异常表达，是目前癌症常见的重要标志物之一，能够在基因表达水平上发挥调节功能[6]。在染色质修饰方面，lncRNA与染色质重塑复合物相互作用，在特定基因组位点诱导异染色质形成，从而导致基因表达降低。此外lncRNA能够通过与RNA结合蛋白，以及转录因子的共刺激因子相互作用，调节靶基因的表达。另外，lncRNA还能够作用于靶基因的主要启动子，从而调控基因的转录。总的来说，lncRNA可以通过与DNA、mRNA和蛋白质的相互作用发挥调节基因表达水平的作用[7-8]。lncRNA表达水平的改变及其突变参与肿瘤的发生和转移[9]。

黑色素瘤是一种恶性程度很高的肿瘤，对于黑色素瘤的诊断和治疗一直是研究的热点[10-12]。研究表明lncRNA在黑色素瘤的生长和转移中也起到重要作用，通过与miRNA的共同作用，参与黑色素瘤的发生发展[13-14]。本研究中，我们发现黑色素瘤组织中lncRNA FEZF1-AS1的表达显著高于癌旁组织。查阅文献发现，lncRNA FEZF1-AS1在胆囊癌、非小细胞肺癌、结直肠癌、宫颈癌等肿瘤中发挥促癌作用，但在黑色素瘤中未见报道[15-18]。接下来，我们沉默了黑色素瘤细胞A375中lncRNA FEZF1-AS1的表达，观察其对A375细胞增殖和侵袭的影响。结果表明，lncRNA FEZF1-AS1可以在体外促进A375细胞的增殖和侵袭能力。在荷瘤小鼠模型中，敲减A375细胞中lncRNA FEZF1-AS1的表达可以降低移植瘤的体积和质量，并且增加小鼠模型的生存期。这些结果表明lncRNA FEZF1-AS1参与黑色素瘤细胞的恶性生物学行为。

研究表明，在多种类型的癌症中，Notch1信号的激活可以促进肿瘤细胞以及肿瘤干细胞的增殖，从而促进肿瘤发生发展[19-20]。Notch1通路在细胞分化和增殖过程中起着重要的调控作用，而Notch1的缺失可诱导表皮增生，分化异常，从而促进肿瘤的形成[21]。并且有报导显示，Notch1信号在黑色素瘤的恶性生物学活性中发挥促进作用[22-24]。本研究中，敲减lncRNA FEZF1-AS1能够降低Notch1的蛋白表达水平，提示lncRNA FEZF1-AS1通过增强Notch1信号促进黑色素瘤细胞A375的增殖和侵袭能力。但是lncRNA FEZF1-AS1如何调节Notch1信号的具体机制还有待进一步研究。

综上所述，本研究表明lncRNA FEZF1-AS1可以促进黑色素瘤细胞的增殖水平和侵袭能力，这种作用与lncRNA FEZF1-AS1增强Notch1信号通路相关，lncRNA FEZF1-AS1有望成为黑色素瘤诊断和治疗的靶点。

参考文献:

[11]邢志超,张佳佳,麦威.外泌体在黑色素瘤中的研究进展[J].现代肿瘤医学,2020,28(10):1777-1780.

[12]任宇,刘宝瑞,邹征云,等.晚期恶性黑色素瘤的靶向及免疫治疗研究进展[J].现代肿瘤医学,2018,26(12):1970-1974.

[20]徐海伟,魏刚,孟杨,等.慢病毒介导的Notch1基因沉默抑制软骨肉瘤SW1353细胞的增殖和侵袭[J].现代肿瘤医学,2019,27(13):2262-2267.

基金资助:国家自然科学基金(编号:82202001);

文章来源:刘冰雪,王润芊,薛林怡,等.lncRNA FEZF1-AS1促进黑色素瘤细胞增殖和侵袭的实验研究[J].现代肿瘤医学,2024,32(19):3631-3635.