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LRP1在肺癌细胞中的表达水平及其生物学功能研究

2024-09-10 31 上传者：管理员

摘要：目的:探讨低密度脂蛋白受体相关蛋白1(low density lipoprotein receptor-related protein 1,LRP1)在肺癌细胞中的表达水平及其生物学意义。方法:常规培养人类肺癌A549细胞，RT-PCR法检测A549细胞中LRP1的mRNA水平。构建针对LRP1的siRNA感染细胞，利用绿色荧光标记载体，通过荧光显微镜观察感染效率，利用RT-PCR检测敲减效率，Western blot检测LRP1表达水平变化。选用A549/LRP1 siRNA细胞系进行功能实验，利用CCK-8实验检测细胞增殖能力的变化，划痕实验检测细胞迁移能力的变化，Transwell侵袭小室实验检测细胞侵袭能力的变化。结果:从定量PCR结果可以看出，A549细胞中，相对于NC组，KD组LRP1基因敲减效率为77.7%,KD组细胞中LRP1的mRNA水平明显低于NC组，差异具有统计学意义(P<0.05);Western blot检测结果显示，KD组LRP1表达水平相对于NC组显著下调。CCK-8检测结果表明相对于NC组，KD组于Day 5的细胞增殖倍数显著下降，差异具有统计学意义(P<0.05)。划痕实验结果显示，相比NC组，KD组细胞划痕8小时、24小时迁移率明显降低，差异具有统计学意义(P<0.05)。Transwell侵袭实验结果显示，在侵袭小室内孵育24 h后KD组细胞侵袭转移率明显降低，差异具有统计学意义(P<0.05)。结论:LRP1对于肺癌A549细胞的生物学功能起着重要作用。下调LRP1能够抑制A549细胞的增殖、迁移及侵袭能力。对于LRP1分子上下游信号通路研究，在肺癌的诊断与治疗领域有一定的临床参考价值。

关键词：
A549细胞
LRP1
侵袭
增殖
肺癌
迁移
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恶性肿瘤是严重威胁中国人群健康的主要公共卫生问题，根据最新的统计数据显示，近年来恶性肿瘤的发病率和死亡率均呈持续上升态势，其中肺癌的发病率占据首位[1],已严重威胁国民健康。肺癌相关的临床和基础研究，已成为肺癌防治研究领域的热点。LRP1又称为CD91、α2巨球蛋白受体(α2-macroglobulin receptor),是低密度脂蛋白(low density lipoprotein, LDL)受体超家族成员之一。LRP1由一段515 kDa的胞膜外亚单位(α链)和一段85 kDa的嵌膜亚单位(β链)构成，这两个亚单位是由一个600 kDa的前体蛋白水解后形成的[2-4]。LRP1在多种细胞组织中广泛表达，如神经元、胶质细胞、内皮细胞、平滑肌细胞、单核细胞、肝细胞、成纤维细胞等[5-6],其主要功能包括转运代谢生物大分子(即清道夫功能)和信号转导两方面，清道夫功能研究较为清楚，但信号转导功能不清楚。除正常细胞外，报道许多肿瘤细胞高表达LRP1[7-16]。LRP1具有促进肿瘤细胞侵袭和迁移的作用[6],但肺癌细胞中其作用机制研究较少。本课题分析非小细胞肺癌细胞中的LRP1表达水平，并以A549细胞为模型，探讨LRP1在非小细胞肺癌中的表达及其生物学功能。

1、材料与方法

1.1材料与试剂

肺癌A549细胞由空军军医大学第二附属医院胸外科实验室提供；细胞培养基(DMEM)购自Corning公司；SYBR PCR试剂盒和反转录试剂盒购自美国Thermo公司；质粒提取试剂盒购自美国Omega公司；琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒购自上海化学试剂公司；胎牛血清购自Ausbian公司；PCR引物由上海吉凯生物工程有限公司合成；抗体购自美国Santa Cruz公司。胰蛋白酶购自上海化学试剂公司；D-Hanks由上海吉凯生物工程有限公司配制；CCK-8试剂购自Sigma公司；96 Wounding Replicator购自VP Scientific公司；侵袭小室试剂盒购自Corning公司。

1.2实验方法

1.2.1细胞培养

肺癌A549和293T细胞用含10%胎牛血清的DMEM培养基在37℃、CO2浓度为5%的培养箱中培养，细胞培养在空军军医大学第二附属医院胸外科实验室进行，常规培育后进行实验。

1.2.2 LRP1 siRNA转染A549细胞

我们设计了针对LRP1特异性的siRNA寡核苷酸序列，经过退火、酶切、连接、转化和测序鉴定，成功构建了针对LRP1的两对小干扰RNA载体：siRNA(5'-GACCAGTGCTCTCTGAATA-3' )和siRNA(5'-GGAGTGGTATTCTGGTATA-3' )。并转染入A549细胞中，利用绿色荧光标记载体，通过荧光显微镜观察转染效率，利用RT-PCR检测敲减效率。结果发现，转染入A549细胞的第一对siRNA敲减效率最高，为77%,选定这对A549/LRP1 siRNA细胞系进行后续的功能实验。

1.2.3实时荧光聚合酶链式反应(RT-PCR)检测LRP1的mRNA水平

我们分别设计了LRP1上下游引物：上游引物5'-CGAGCATAACTGCCTGGGTA-3';下游引物5'-ATCTGCCTGAAGCTGAAAGC-3'。以及内参GAPDH上游引物5'-TGACTTCAACAGCGACACCCA-3'和下游引物5'-CACCCTGTTGCTGTAGCCAAA-3',RT-PCR程序检测了肺癌A549细胞系中LRP1的水平。

1.2.4蛋白印迹法(Western blot)检测LRP1表达水平

加入适量预冷的组织蛋白裂解液并匀浆组织，冰浴10～20分钟后用超声细胞破碎器处理，4℃、12 000×g离心30分钟后将上清移入另一新的EP管，Bradford法进行蛋白定量，保存。Western blot蛋白样品加入上样缓冲液后煮沸样品5 min, SDS-PAGE电泳，蛋白上样量为60μg。10%脱脂奶粉封闭2 h,加入LRP1的抗体，4℃孵育过夜，TBST洗膜3次，每次10 min,加二抗，室温孵育2 h, TBST洗膜3次，暗室ECL显影，结果扫描并定量分析。

1.2.5细胞生物学功能实验

利用CCK-8实验检测细胞增殖能力的变化，通过检测细胞活力来验证LRP1基因对A549细胞增殖的影响，此操作为CCK-8实验的通用操作，按照实验流程进行。通过划痕实验观察肿瘤细胞的迁移能力，分析LRP1基因对A549细胞增殖的影响，具体步骤按照划痕实验通用操作进行。利用Transwell侵袭小室实验检测细胞侵袭能力的变化，通过检测目的细胞在小室中向含血清培养基的侵袭能力来验证LRP1基因对A549细胞侵袭能力的影响，实验步骤按通用操作执行。

1.3统计学处理

采用SPSS 18.0统计软件进行数据分析，数据采用均数±标准差

表示，两组数据比较采用t检验，P<0.05为差异具有统计学意义。

2、结果

2.1 LRP1敲减效率及mRNA水平检测

相对于NC组，KD1组LRP1基因敲减效率为77.7%,KD2组LRP1基因敲减效率为65%,KD1组和KD2组细胞中LRP1的mRNA水平都明显低于NC组，差异具有统计学意义(P<0.05)(图1)。选用KD1组进行后续实验。

2.2 Western blot检测LRP1蛋白表达变化

Western blot检测结果显示，KD组LRP1蛋白表达水平相对于NC组显著下调(图2)。

2.3细胞功能学实验结果

2.3.1 CCK-8检测结果

表明相对于NC组，KD组于Day 5的细胞增殖倍数显著下降，差异具有统计学意义(P<0.05)(图3)。

2.3.2划痕实验结果

相比NC组，KD组细胞划痕8小时、24小时迁移率明显降低，差异具有统计学意义(P<0.05)(图4-6)。

图1各组LRP1基因敲减效率对比

图2各组LRP1蛋白表达水平对比(*P<0.05)

2.3.3 Transwell侵袭实验结果

在侵袭小室内孵育24 h后KD组细胞侵袭率明显降低，差异具有统计学意义(P<0.05)(图7-8)。

3、讨论

分子靶点的研究是肿瘤基础研究的热点，以往的文献报道了许多肿瘤细胞会高表达LRP1[7,9,12],LRP1具有促进肿瘤细胞侵袭和迁移的作用[6],但其作用机制研究较少，可能是通过促进肿瘤细胞分泌基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases, MMPs)实现的[2-3,5,10]。虽然LRP1能够激活Shc、Dab1、JIP1、PSD-95、CED-6/GULP、65Fe等多个下游信号转导适配蛋白，但这些信号分子中哪些介导LRP1促进肿瘤细胞侵袭和迁移的功能并不确定。我们课题组前期的研究以乳腺癌MDA-MB-231细胞系为模型，采用慢病毒介导的siRNA干涉HIF-1α,发现eHsp90的分泌显著下降，MDA-MB-231细胞的侵袭和迁移能力也显著降低；采用慢病毒介导的siRNA干涉LRP1也能抑制MDA-MB-231细胞的侵袭和迁移；同时发现eHsp90α的功能依赖于LRP1。即肿瘤细胞存在一条“HIF-1α→eHsp90α→LRP1”的促侵袭和迁移的自分泌通路，LRP1作为跨膜受体，将与胞外eHsp90α结合而发挥生物学功能[17-19]。但是该通路LRP1的下游分子机制尚未阐明。鉴于肺癌在中国的高发病率，同时在肺癌细胞中该通路信号相关研究开展甚少，因此，我们设计了本课题，旨在以肺癌细胞为模型，继续该分子通路的研究。

图3各组对波长450 nm光的吸收率变化倍数的对比OD450在这里反映了具有活力的细胞的数量。

图4各组8小时细胞划痕

图5各组24小时细胞划痕

图6各组8小时和24小时平均迁移率对比

我们检测了LRP1表达下调对于A549细胞生长的影响。LRP1表达下调后，与转染了src-siRNA的细胞相比，A549细胞的生长受到明显抑制。采用Transwell实验和单层细胞伤痕愈合实验检测各个细胞株在体外的迁移侵袭能力。结果显示与亲本细胞和无关序列载体细胞株相比，干扰LRP1 siRNA的细胞可显著抑制肺癌细胞A549的迁移侵袭能力，差异具有统计学意义，提示LRP1与非小细胞肺癌细胞的迁移侵袭能力呈正相关。为了寻找与肺癌转移信号通路密切相关的LRP1的关联基因，我们课题的下一步工作是利用前期建立的LRP1干扰前后的A549细胞，进行3 vs 3全基因表达谱芯片，进行LRP1下游靶基因的高通量筛选，以及LRP1下游靶基因的验证工作。

图7各组孵育24小时后的细胞侵袭检测(结晶紫染色×200)

图8各组孵育24小时后的侵袭细胞数

本研究结果显示，肺癌A549细胞表达LRP1,LRP1对A549细胞的肿瘤生物学行为起着重要作用。对于LRP1分子及其上下游信号的研究，在肺癌的临床方面具有一定指导意义。

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