小细胞肺癌(sclc)约占肺癌的15%,由于生物学恶性程度较高,是肺癌预后较差的亚型[1]｡MIr-21是研究较为深入的一类非编码rna,在多种恶性肿瘤中呈高表达,如乳腺癌､胃癌､肝癌､结肠癌等,与肿瘤细胞的增殖､侵袭､迁移､化疗耐药等恶性生物学行为密切相关[2-3]｡研究显示,MIr-21可够通过调控pten､pdcd4､reck等多个关键靶基因表达,促进肺癌的恶性进程,但具体的分子机制目前尚不清楚[4]｡dna甲基化是较重要的一种表观遗传学修饰方式,其在细胞周期调控和细胞分化调控等诸多生命活动中发挥重要作用,成为遗传学､肿瘤学研究的热点[5]｡长散在核元件1(line-1)是人类基因组中最丰富的一类非编码重复序列,近年来,line-1在肿瘤发生､发展过程中的效应作用逐渐被揭示｡研究发现,包括肺癌在内的多种恶性肿瘤细胞中line-1序列普遍表现出异常甲基化的状态[6-7]｡这种异常甲基化能够调控line-1的转录和转座子活性,进而影响下游靶基因的表达,最终导致肿瘤的发生和发展[8]｡本研究课题组前期预实验结果显示,MIr-21可影响sclc细胞line-1基因的甲基化修饰｡基于MIr-21在肺癌恶性进程中的研究现状和课题组前期工作基础,本研究以MIr-21在sclc中的效应作用为研究切入点,对其参与sclc恶性进程可能的分子生物学机制进行初步研究,旨在为靶向抗sclc治疗探寻药物作用新靶点｡

1、材料与方法

1.1细胞培养人源性sclc细胞株h69ar购自美国模式培养物集存库,将其置于含10%胎牛血清的rpmi1640培养基(含1%青-链霉素)中,在37℃､5%co2恒温细胞培养箱中进行培养,隔天换液,待细胞融合度达80%时,采用0.25%胰蛋白酶消化传代,磷酸盐缓冲液洗涤后重悬细胞,调整浓度为1×106/Ml进行下一步分组实验｡

1.2主要试剂rpmi1640培养基购自美国gIBCO公司,MIr-21过表达和低表达序列(分别为attgtgcgcatgtg和cgcgtgcgacaaa)由上海生工细胞实验中心设计并合成,脂质体lIPOFECTAMINE2000转染试剂购自赛默飞世尔科技(中国)有限公司,triZOLrna提取试剂购自美国iNVITROGEN公司,反转录和聚合酶链反应(pcr)扩增试剂购自日本tAkArA公司,MIr-21和Β-ACTIN引物购自上海芯超生物科技有限公司,cck8试剂盒和凋亡试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司,tRANSWELL小室购自美国cORNING公司,核酸抽提试剂盒购自北京天根生化科技有限公司,探针引物购自上海闪晶生物科技有限公司｡

1.3方法

1.3.1MIr-21过表达和低表达h69ar细胞模型构建及分组本实验设野生h69ar细胞组(对照组)､MIr-21过表达组和MIr-21低表达组,每组设置6个复孔,结果取平均值｡对照组不做干预,正常培养;MIr-21过表达组和MIr-21低表达组分别根据转染试剂盒提示说明书步骤完成转染,并采用实时荧光定量pcr检测MIr-21转染效率｡引物序列见表1｡反应程序为94℃预变性5MIN,94℃45S､60℃45S､72℃45S,共循环40次;72℃延伸10MIN,最后采用2-δδcT法计算MIr-21相对表达水平｡

表1引物序列

1.3.2cck-8实验检测细胞增殖率3组细胞连续培养24､48､72H后,根据cck8试剂盒说明书于96孔板中接种细胞悬液,细胞呈贴壁生长后每孔加入cck8溶液,反应4H后于酶标仪上检测450NM波长处的吸光度,并计算细胞增殖率｡

1.3.3流式细胞技术检测细胞凋亡情况3组细胞培养48H后,根据aNNEXINv/7add凋亡试剂盒提示说明书依次加入反应液,快速置于流式细胞分析仪中检测细胞凋亡情况｡

1.3.4tRANSWELL实验检测细胞侵袭和迁移能力在tRANSWELL小室上层内接种对应处理后的细胞(侵袭实验需提前使用基质胶对tRANSWELL小室内膜进行包被),tRANSWELL上室中加入无血清培养基,下室中加入20%血清浓度的培养基,随后置于培养箱中,48H后进行染色､观察｡实验以3个随机视野中小室外层膜上黏附的细胞作为统计量,计算迁移和侵袭的细胞数｡

1.3.5tAQMAN实时荧光定量pcr检测line-1基因甲基化按dna提取､亚硫酸盐处理､dna甲基化修饰和mETHYlIGHT法检测步骤进行操作｡探针5'端标记荧光报告分子r(6fam),3'端标记荧光淬灭分子q(bhq1),并磷酸化防止延伸｡在96孔板上进行tAQMANpcr反应,反应体系为mASTERmIX8.00Μl､line-1基因正向引物､反向引物各2.75Μl､6fam标记探针(125NMOL/l)5.50Μl､重亚硫酸盐处理dna1.00Μl,调节总体积为25.00Μl｡反应程序为预变性95℃10MIN,95℃15S进行50个循环,最后60℃1MIN退火和延伸｡line-1基因的甲基化程度=样品(line-1/aLU-c4)/甲基化标准(line-1/aLU-c4)×100%｡line-1基因引物序列见表2｡详细方案参考张小丹等[9]的相关研究方法｡

表2line-1基因引物和探针序列

1.4统计学处理采用spss22.0统计软件进行数据处理和分析｡符合正态分布的计量资料以X±S表示,多组间比较采用单因素方差分析,进一步两两比较采用lsd-T检验;2组单指标多时点数据采用重复测量方差分析,若存在交互效应,则进一步行单独效应分析,通过单因素重复测量方差分析组内效应,通过多变量方差分析组间效应｡以p<0.05为差异有统计学意义｡

2、结果

2.13组细胞不同时间点h69ar细胞增殖率比较重复测量方差分析结果显示,3组h69ar细胞增殖率存在时间､组间和交互效应(f时间=134.022､p时间<0.001,f组间=47.200､p组间<0.001,f交互=6.470､p交互<0.05)｡单因素重复测量方差分析结果显示,对照组､MIr-21低表达组及MIr-21过表达组不同时间点h69ar细胞增殖率为24H<48H<72H,且两两比较,差异均有统计学意义(p<0.05);多变量方差分析结果显示,MIr-21过表达组和MIr21低表达组48H及72Hh69ar细胞增殖率比较,差异均有统计学意义(p<0.05)｡见表3｡

表33组细胞不同时间点h69ar细胞增殖率比较(X±S,%)

2.248H后3组h69ar细胞凋亡率比较48H后,对照组h69ar细胞凋亡率为(18.6±3.2)%,MIr-21过表达组为(5.7±0.6)%,MIr-21低表达组为(34.9±4.6)%,48H后3组h69ar细胞凋亡率比较,差异有统计学意义(f=16.639,p<0.001)｡与对照组比较,48H后MIr-21过表达组h69ar细胞凋亡率明显降低(p<0.05),而MIr-21低表达组h69ar细胞凋亡率明显升高(p<0.05);与MIr-21过表达组比较,48H后MIr-21低表达组h69ar细胞凋亡率明显升高(p<0.05)｡

2.348H后3组侵袭和迁移细胞数目比较与对照组比较,48H后MIr-21过表达组h69ar细胞的迁移和侵袭细胞数目显著增多(p<0.05),MIr-21低表达组h69ar细胞的迁移和侵袭细胞数目显著减少(p<0.05);48H后与MIr-21过表达组比较,MIr-21低表达组h69ar细胞迁移和侵袭细胞数目显著减少(p<0.05)｡见表4｡

表448H后3组侵袭和迁移细胞数目比较(X±S,个)

2.43组h69ar细胞line-1基因的甲基化率比较对照组h69ar细胞line-1基因的甲基化率为(1.86±0.23)%,MIr-21过表达组为(1.09±0.09)%,MIr-21低表达组为(2.32±0.64)%,3组h69ar细胞line-1基因的甲基化率比较,差异有统计学意义(f=9.635,p<0.001)｡与对照组比较,MIr-21低表达组h69ar细胞line-1基因的甲基化率明显升高(p<0.05),MIr-21过表达组h69ar细胞line-1基因的甲基化率明显降低(p<0.05);与MIr-21过表达组比较,MIr-21低表达组h69ar细胞line-1基因甲基化率明显升高(p<0.05)｡见图1｡

图13组h69ar细胞line-1基因甲基化情况

3、讨论

sclc主要起源于神经内分泌细胞,具有高度侵袭性和较强的转移能力,确诊时往往处于中晚期,失去手术机会[10]｡即使接受化疗和放疗等综合治疗,5年总生存率也仅5%~10%,远低于其他类型肺癌[11]｡因此,深入探讨sclc的发病机制,寻找新的治疗靶点对改善患者生存预后具有重要意义｡

本研究结果显示,MIr-21过表达处理后肿瘤细胞的增殖率､侵袭和迁移数目明显增多,而凋亡率降低;相反MIr-21低表达处理后细胞增殖率､侵袭和迁移数目明显减少,而凋亡率升高,提示MIr-21在sclc的发生中具有促癌作用,具有癌基因的生物学属性｡程万里等[12]的研究指出,MIr-21可作为新型标志物辅助非sclc(nsclc)的临床诊断,与肿瘤的临床病理特征密切相关｡王应霞等[13]的研究同样证明MIr-21高表达与nsclc的恶性程度及表皮生长因子受体的表达密切相关｡MIr-21通过调控多个下游靶基因,如pten､pdcd4､reck等参与调控肺癌细胞的增殖､凋亡､侵袭､转移等关键生物学过程｡因此,MIr-21在肺癌发生､发展中发挥重要作用,是1个潜在的新型肺癌治疗靶点｡但是,关于sclc中MIr-21表达的研究报道较少,因此,本研究结果有一定的创新性和临床价值｡

本研究结果还发现,MIr-21过表达后,h69ar细胞line-1基因的甲基化修饰显著减弱;而敲低MIr-21后,h69ar细胞line-1基因的甲基化修饰则显著增强,提示MIr-21可能通过影响sclc细胞line-1基因的甲基化修饰,进而影响sclc细胞增殖､侵袭和迁移情况等恶性生物学行为｡基因的甲基化修饰通常发生在cPg富集区,即cPg岛｡大多数cPg岛保持低甲基化状态,有利于基因的正常转录｡但在部分肿瘤细胞中往往出现cPg岛的异常甲基化修饰,进而诱导肿瘤相关阻遏基因的转录沉默,从而促进肿瘤的发生和发展[14]｡研究发现,肺癌组织中line-1基因甲基化率通常较低,这种异常低甲基化不仅影响了line-1自身的生物学功能,也可能通过级联效应调控其他相关癌基因的表达,从而促进sclc的发生和发展[15-16]｡刘玉玲等[17]研究显示,MIrna-103/mthfr轴通过抑制肝细胞癌中line1基因的甲基化率,进而影响肝癌的发生｡异常的dna甲基化(某些基因的高甲基化和反转录转座子的低甲基化)被认为是恶性细胞转化的驱动力之一[18]｡在癌症患者血液循环dna中检测到表观遗传变化可作为癌症的诊断标志物｡ponomaryova等[19]研究比较了肺癌患者治疗前与健康受试者､支气管炎和慢性阻塞性肺疾病患者血液循环dna中line-1基因甲基化率,结果显示肺癌患者line-1基因甲基化率显著降低,提示line-1基因甲基化程度的定量分析对于区分肺癌和慢性炎症性肺部疾病有一定的参考价值｡

line-1基因甲基化率的分子诊断方法具有较高的灵敏度和特异度,可作为诊断肺癌的潜在生物标志物｡这种无创性的分子诊断方法有望为早期肺癌的筛查和诊断提供新方案｡不同肺癌亚型及不同分期的line-1基因甲基化率也存在一定差异｡这为临床上鉴别诊断sclc､评估预后提供了新的分子标志物｡此外,line-1基因甲基化率的动态变化也可能反映肺癌治疗反应和复发风险[20]｡因此,将line-1基因甲基化状态纳入肺癌的分子分期和预后评估体系,有助于为患者提供更加精准的个体化治疗方案｡

本研究明确了MIr-21与line-1基因的甲基化修饰的关系,但由于实验条件所限,本研究仅对MIr21参与sclc恶性演变进程相关分子机制的初步探究,未对line-1基因甲基化相关促癌信号通路作进一步的拓展研究｡因此,后续研究尚需在研究的深度和层次方面作进一步拓展｡

综上所述,MIr-21具有癌基因的生物学属性,其可能通过抑制line-1基因甲基化修饰促进sclc的恶性进程,可为靶向抗sclc治疗探索药物作用新靶点提供借鉴和参考｡

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基金资助:新疆维吾尔自治区重点实验室新疆神经系统疾病研究重点实验室开放课题(XJDX1711-2233);

文章来源:于璐,陈亚豪,李辉,等.miR21-对小细胞肺癌进展的调控作用及机制研究[J].检验医学与临床,2025,22(06):830-834.