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透明质酸-甘氨酸-喜树碱聚合物胶束的制备及其体外抗肿瘤活性研究

2024-09-21 164 上传者：管理员

摘要：目的合成透明质酸-甘氨酸-喜树碱聚合物胶束（HA-Gly-CPT胶束），并且评价该胶束的质量，初步研究其体外抗肿瘤活性。方法利用甘氨酸将透明质酸与喜树碱连接，形成两亲性聚合物；通过红外光谱法、核磁共振氢谱法表征其结构；直接溶解法制备HA-Gly-CPT胶束，马尔文激光粒度仪测定胶束粒径、Zeta电位，并考察胶束的稳定性；透射电镜观察胶束的外观；透析法研究其pH响应性体外释放；MTT法检测其抗肿瘤活性。结果红外光谱、核磁共振氢谱结果确定两亲性聚合物成功合成；HA-Gly-CPT胶束呈球形，平均粒径为（279.86±4.15）nm，Zeta电位为（-20.17±0.52）mV，在酸性介质中（pH 5.0），HA-Gly-CPT在48 h喜树碱释放度达到50%。MTT实验结果表明HA-Gly-CPT胶束对正常细胞L929生长无影响，而50 μg·mL-1 HA-Gly-CPT胶束对肿瘤细胞MCF-7生长抑制率高于80%。结论成功合成了两亲性聚合物，并制备质量良好且具有pH响应的HA-Gly-CPT胶束。体外实验证明HA-Gly-CPT胶束具有明显的抗肿瘤活性。

关键词：
pH响应
喜树碱
抑制作用
抗肿瘤活性
透明质酸
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喜树碱(camptothecin，CPT)，一种喹啉生物碱，具有显著的抗肿瘤活性，其作用机制是通过与拓扑异构酶Ⅰ-DNA形成复合物，进而阻止DNA复制及RNA合成，发挥抗肿瘤作用[1]。体外实验研究表明，喜树碱对胃癌、肝癌、膀胱癌等多种肿瘤均有一定的抑制作用[2]。但是疏水性、内酯环结构的不稳定性和毒副作用大等缺点限制了喜树碱的临床应用[3]。所以，改善上述缺陷是喜树碱、喜树碱衍生物以及相关制剂的研究重点。

常见纳米载药系统有脂质体、胶束、金属纳米粒等，其中胶束较为成熟，在一些国家已经进入临床后期阶段以及临床应用阶段[4]。纳米载药系统通常基于高渗透长滞留效应(enhanced permeability and retention effect，EPR效应)，将药物被动靶向递送到肿瘤部位[5]。与正常细胞相比，肿瘤组织的微环境具有弱酸性、高活性氧浓度、高还原电位以及一些酶的过量表达等特征[6]。基于肿瘤组织微环境的差异，通过构建pH、谷胱甘肽(GSH)[7]、活性氧(ROS)[8]响应键来实现响应性释放药物，从而改善化疗药物的毒副作用大等缺陷，是目前药物改造的常用方法。pH响应键构建较为成熟，典型pH响应键有酯键[9]、亚胺键[10]、β-羧酸酰胺键[11]等，其在生理环境(pH 7.4)保持相对稳定，而在肿瘤细胞外微环境(pH 6.5～7.2)，肿瘤细胞内环境(pH 4.0～6.0)等酸性环境下化学键响应性断裂，从而释放出化疗药物。

透明质酸(hyaluronic acid，HA)是一种大分子多糖，具有优良生物相容性，可降解性和低免疫性。其结构具有羧基活性基团，可以通过化学键与疏水基团相连，从而形成两亲性聚合物。另有研究发现HA可特异性靶向肿瘤细胞中存在的CD44受体，实现主动靶向抗肿瘤作用[12]。

目前，尚未见报道利用HA大分子骨架结构通过甘氨酸(glycine，Gly)接枝化疗药物喜树碱以制备高效低毒前药胶束的相关研究。基于以上原因：本研究将甘氨酸修饰的喜树碱，与亲水性多糖透明质酸相连，形成pH响应性的两亲性透明质酸-甘氨酸-喜树碱聚合物胶束(HA-Gly-CPT胶束)并对其抗肿瘤作用进行初步探索。

1、材料

透明质酸、喜树碱(萨恩化学技术上海有限公司)，1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDCI)、4-二甲氨基吡啶(DMAP)、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)(上海源叶生物科技有限公司)，BOC-甘氨酸、三氟乙酸(安耐吉化学有限公司)，N，N-二甲基甲酰胺(DMF)、二氯甲烷(DCM)(天津富宇精细化工有限公司，分析纯)，二甲基亚砜(DMSO)(兰杰柯科技有限公司)，小鼠成纤维细胞(L929)(尚恩生物有限公司)，人乳腺癌细胞(MCF-7)、RPMI 1640培养基(美国Hyclone公司)，胎牛血清(北京赛奥美细胞技术有限公司)，链霉素-青霉素(北京碧云天生物技术有限公司)，Bio Tek酶标仪(Gene Company Limited)。

2、方法

2.1 HA-Gly-CPT聚合物的合成及表征

取0.35 g喜树碱、0.30 g BOC-甘氨酸、0.96 g EDCI、0.12 g DMAP溶于10 mL二氯甲烷中，室温反应过夜，硅胶柱层析(200～300目)纯化，得到产物CPT-Gly-BOC。

CPT-Gly-BOC加入20%三氟乙酸的二氯甲烷溶液中，搅拌2 h，加入适量甲醇旋干3次，即得产物CPT-Gly。

取0.10 g透明质酸(羧基摩尔量：24.79 mmol)、0.048 g EDCI和0.039 g NHS溶于15 mL DMF与水混合溶液(3∶1)，室温活化1 h。0.25 g CPT-Gly溶于15 mL DMF中并加入活化溶液中，室温反应24 h。反应液用3500 Da透析袋透析2 d，每4 h更换去离子水，冷冻干燥得到HA-Gly-CPT聚合物。具体合成路线见图1。

利用红外光谱仪测定透明质酸、HA-Gly-CPT聚合物的红外吸收曲线，溴化钾压片法制备；磁共振氢谱测定CPT-Gly-BOC、HA-Gly-CPT聚合物的磁共振氢谱，溶剂为氘代氯仿、重水。

2.2 HA-Gly-CPT胶束的制备与表征

2.2.1 HA-Gly-CPT胶束的粒径，Zeta电位与稳定性

采用直接溶解法结合探头超声法制备HA-Gly-CPT胶束。称取20 mg HA-Gly-CPT聚合物溶解于20 mL水，冰浴探头超声30 min(200 W，超声3 s停2 s)，过0.45μm微孔滤膜，得到HA-Gly-CPT胶束溶液(1 mg·mL-1)。

图1 HA-Gly-CPT聚合物的合成路线

马尔文激光粒度仪测定HA-Gly-CPT胶束的粒径和Zeta电位；HA-Gly-CPT(1 mg·mL-1)避光4℃保存7 d，每日相同时间检测胶束的粒径、PDI。

2.2.2 HA-Gly-CPT胶束的外观

利用透射电镜(TEM)观察胶束的形貌特征。取HA-Gly-CPT胶束溶液用去离子水稀释一定浓度，滴加在铜网上，静置10 min，用滤纸吸干，再滴加2%的磷钨酸溶液负染色5 min，自然挥干，上机测定。

2.3 HA-Gly-CPT胶束的体外释放

透析法研究胶束的pH响应性体外释放行为。取2 mL HA-Gly-CPT胶束溶液(3 mg·mL-1)加入3500 Da透析袋内，置于70 mL pH 7.4和pH 5.0 PBS溶液(含0.5%吐温80)中，37℃、80 r·min-1下振荡48 h。在1、2、4、6、8、10、12、24和48 h时，取1 mL释放介质，并补加1 mL PBS。

利用高效液相色谱仪测定释放介质中CPT的含量[13]。色谱柱：Agilent5 TC-C-18(2)(250 mm×4.6 mm)；流动相：甲醇-水=70∶30；检测波长：360 nm；柱温：25℃；流速：1.0 mL·min-1；进样量：20μL。

2.4细胞毒性

取对数生长期的MCF-7、L929细胞，胰酶消化，血球计数板计数，制成细胞悬液，以每孔3000个细胞接种到96孔板内。37℃、5%CO2细胞培养箱中孵育24 h后，加入不同浓度的HA-Gly-CPT胶束，继续培养48 h。每孔加入20μL MTT溶液(5 mg·mL-1)后，置于培养箱4 h。弃去上清液，每孔加入100μL的DMSO溶液，摇床缓慢振荡10 min。结晶充分溶解后，用酶标仪于490 nm处测定各孔的吸光度，计算细胞存活率。

2.5统计学结果分析

采用GraphPad Prism 9统计软件分析，计量数据用均数±标准差(x¯±s)表示，组间比较采用单因素方差分析，P<0.05为差异具有统计学意义。

3、结果

3.1 HA-Gly-CPT聚合物的结构表征

透明质酸、HA-Gly-CPT的红外光谱如图2A所示，1616 cm-1红外吸收峰(羧基中-C=O伸缩振动峰)减弱，以及1747 cm-1红外吸收峰(酯键中-C=O伸缩振动峰)的新增表明HA-Gly-CPT成功合成。

CPT-Gly-BOC核磁氢谱中(见图2B)，8.43～7.36处的信号峰，1.0信号峰a分别为喜树碱喹啉环中质子氢，内酯环中甲基质子峰(-CH3)，而1.42信号峰b对应BOC叔丁基质子峰，表明CPT-Gly-BOC成功合成。

HA-Gly-CPT核磁氢谱中(见图2C)，1.91信号峰a，4.39～4.45信号峰b分别为透明质酸中甲基质子氢(-CO-CH3)，糖环中C-1质子氢峰，并且CPT喹啉环环上质子氢为8.15信号峰c的出现，确定HA-Gly-CPT成功合成。

由透明质酸中的乙酰氨基中甲基质子氢a与喜树碱中喹啉环质子c的积分面积比值得到CPT的取代度(DS，每100个透明质酸糖单元中CPT的基团数)。根据HA-Gly-CPT的核磁氢谱，CPT的取代度约为13%。

3.2 HA-Gly-CPT胶束的表征

HA-Gly-CPT胶束溶液与CPT水溶混悬液对比(见图3A)，HA-Gly-CPT溶液澄清，并有淡蓝色乳光。胶束的平均粒径为(279.86±4.15)nm(见图3B)，粒径适中，Zeta电位为(-20.17±0.52)mV(见图3C)。胶束表面电位较大，存在较大电子斥力，有利于胶束体系稳定，减少胶束的聚集与沉淀。TEM结果表明HA-Gly-CPT胶束外貌呈圆形(见图3D)。

3.3 HA-Gly-CPT胶束的稳定性的考察

稳定性结果表明，HA-Gly-CPT胶束7 d内平均粒径为(304.58±22.77)nm，平均PDI为(0.31±0.03)，7 d内粒径、PDI无显著改变。表明HA-Gly-CPT胶束水溶液在避光4℃条件下7 d内具有良好的稳定性。

3.4 HA-Gly-CPT胶束的体外释放

利用标准曲线法来测量释放介质中喜树碱的含量。标准曲线为Y=69.18X-9.59，r=0.9992(n=5)，结果表明喜树碱在0.25～10μg·mL-1内与峰面积线性关系良好。

48 h时，在pH 5.0条件下，喜树碱的累计释放率达到50%；而在pH 7.4条件下，喜树碱的累计释放率仅为20%(见图4)。结果表明在酸性环境(pH 5.0)下，HA-Gly-CPT胶束的释放量得到提高，证明HA-Gly-CPT胶束具有pH响应性，在酸性环境下酯键响应性断裂，从而促进喜树碱的释放。

3.5 HA-Gly-CPT胶束抑制肿瘤细胞生长

MTT实验结果显示(见图5)，在50μg·mL-1的HA-Gly-CPT胶束存在下，正常细胞L929存活率在80%以上，表明HA-Gly-CPT胶束对L929细胞生长无影响。而对于肿瘤细胞MCF-7细胞，10μg·mL-1的HA-Gly-CPT胶束对其生长抑制率高于50%，浓度为50μg·mL-1时生长抑制率高于80%，结果表明HA-Gly-CPT胶束具有良好的生物相容性及抗肿瘤活性。

4、讨论

传统纳米载药系统通过设计两亲性聚合物物理包埋喜树碱，比如聚乙二醇-聚乳酸-羟基乙酸(PEG-PLGA)等，从而提高喜树碱的稳定性与生物利用度等。但是其载药系统存在药物过早释放，肿瘤穿透能力差等缺陷[14]。而肿瘤环境刺激响应型纳米载药系统基于响应肿瘤组织的信号(pH、ROS、还原电位等)来实现药物的可控制性释放，既解决了传统纳米载药系统的不足，又在减少毒副作用、增加化疗药物的生物利用度等方面展现出巨大潜力[15]。

本文通过以喜树碱为疏水端，透明质酸为亲水端，用甘氨酸连接两端合成HA-Gly-CPT聚合物，通过IR、1H-NMR对其结构进行表征与确定；直接溶解法制备胶束，考察其粒径、Zeta电位和稳定性，结果表明HA-Gly-CPT胶束质量良好。透析法研究其pH响应性体外释放，在酸性环境下，酯键响应性断裂，喜树碱的释放量在48 h时达到50%，表明HA-Gly-CPT胶束具备pH响应性。有研究显示，在肿瘤组织环境中酯酶的含量增高，会促进酯键进一步水解，提示在体内喜树碱的释放量会进一步提高，后续将在体内进行验证实验。MTT实验表明，HA-Gly-CPT胶束对L929细胞无生长无影响，具有良好生物相容性，而对于MCF-7细胞，50μg·mL-1胶束浓度时对其生长抑制率达到80%。其原因可能为，HA-Gly-CPT胶束的pH响应性以及胶束中HA可特异性结合肿瘤细胞中的CD44受体，进而更易进入肿瘤细胞而导致。

综上所述，HA-Gly-CPT胶束在酸性环境下，甘氨酸的羧基与喜树碱羟基形成的酯键响应性断裂，定向释放出喜树碱，可克服喜树碱化疗药物的缺陷，解决传统纳米载药系统的不足。

图2 HA-Gly-CPT聚合物的结构表征

图3 HA-Gly-CPT胶束的外貌(A)，粒径(B)，zeta电位(C)和TEM(D)

图4不同pH下喜树碱的体外释放情况

图5 HA-Gly-CPT胶束对L929和MCF-7细胞存活率的影响

参考文献:

[3]赵婷婷,蔡泽东,杜琳琳,等.喜树碱类抗肿瘤药物的递送系统研究[J].中国新药杂志,2023,32(3):246-254.

[6]荆晓东,孙莹,于冰,等.肿瘤微环境响应药物递送系统的设计[J].化学进展,2021,33(6):926-941.

基金资助:黑龙江省自然科学基金项目(No.LH2020H026); 2023年黑龙江省大学生创新创业训练计划项目(No.S202310226007); 2023年哈尔滨医科大学大学生创新创业训练计划项目(No.202310226048);

文章来源:宋帅恒,杜昊洋,磨莲清,等.透明质酸-甘氨酸-喜树碱聚合物胶束的制备及其体外抗肿瘤活性研究[J].中南药学,2024,22(09):2332-2336.