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分析国内rhG-CSF理化对照品的质量情况

2020-06-18 646 上传者：管理员

摘要：目的分析评价国内12家生产企业重组人粒细胞刺激因子（rhG-CSF）理化对照品的质量情况。方法对rhG-CSF理化对照品进行常规检测（包括生物学活性、蛋白质含量、比活性、非还原SDS-PAGE纯度、反相高效液相纯度、等电点、N-端氨基酸序列）和结构确证（包括质谱分子量、液质肽图、二硫键分析）。结果12家生产企业的rhG-CSF理化对照品比活性大致范围在（6.012.0）×107IU/mg；纯度均大于96.0%；等电点主区带均在5.86.6区间内；N-端氨基酸序列为MTPLGPASSLPQSFL或TPLGPASSLPQSFLL；经结构确证，其主体结构相同。结论国内各生产企业自行控制的rhG-CSF理化对照品总体质量良好，可对制品进行质量控制。关键词：

关键词：
rhG-CSF
理化对照品
结构确证
质量控制
质量评价
重组人粒细胞刺激因子
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重组人粒细胞刺激因子是我国治疗性重组生物制品的重要产品之一，为小容量注射剂，主要用于治疗放疗、化疗以及骨髓移植后中性粒细胞减少症[1]。安进公司生产的rhG-CSF首先于1991年由美国FDA批准上市，目前我国有15家制药企业生产rhG-CSF,10个规格，69个批准文号[2]。国内生产的rhG-CSF均由含hG-CSF基因质粒的大肠埃希菌表达，经发酵、分离、高度纯化后获得原液，再经制剂和分装等工艺获得成品。

rhG-CSF由174个氨基酸残基组成，平均相对分子质量为18667.7(N-端为蛋氨酸起始的分子，含有175个氨基酸残基，平均相对分子质量为18798.9），含有5个半胱氨酸，形成两对二硫健，即Cys36-Cys42和Cys74-Cys64，无糖基修饰。据文献报道，其生物学活性与天然G-CSF无明显区别[3]。

rhG-CSF理化对照品是制品质量控制中的关键参照之一，可作为肽图和等电点分析等项目的对照品用于制品质量控制，但由于其稳定性、原液缓冲液等原因，rhG-CSF理化对照品一直由生产企业自行控制。本研究收集了国内12家生产企业rhG-CSF理化对照品进行检测，并汇总数据，对国内rhG-CSF理化对照品的总体情况进行分析和评价。

1、材料与方法

1.1主要试剂及仪器

国内12家生产企业rhG-CSF理化对照品为本室留样；rhG-CSF生物学活性国家标准品（98/01）和rhG-CSF蛋白定量标准品（270023-200801）由中国食品药品检定研究院提供；等电点标准品（批号：9594506）购自美国GEHealthcare公司；乙腈（色谱纯）购自美国FisherChemical公司；三氟乙酸（分析纯）购自梯希爱（上海）化成工业发展有限公司；甲酸（分析纯）购自阿拉丁试剂（上海）有限公司；氨基酸测序用标准品及所用试剂、N-端氨基酸序列分析仪SEQUENCER21A均购日本自岛津公司；Glu-C蛋白酶购自美国ThermoScientific公司；其他试剂均为分析纯；HPLC色谱仪2695、紫外可见光检测器2487、色谱柱Symmetry300C18(4.6mm×250mm）、超高效液相色谱系统ACQUITYH-Class、色谱柱BEH300C4(3.5μm,2.1mm×50mm）、BEH300C18(1.7μm,2.1mm×100mm）、质谱仪XevoG2QTof和Unify操作软件均购自美国Waters公司；酶标仪MolecularDeviceplus5购自美国MD公司；快速电泳仪PhastSystemseparationandcontrolunit购自美国GE公司。

1.2生物学活性检测

采用《中国药典》三部（2015版）通则3525中，NFS-60细胞/溴化四唑蓝（MTT）显色法/酸性裂解液/四参数方程分析法。

1.3蛋白质含量检测

采用《中国药典》三部（2015版）通则0731中第二法———福林酚法及通则3124中的高效液相法。

1.4比活性计算

各生产企业的rhG-CSF理化对照品的生物学活性和蛋白质含量彼此不同，采用比活性（生物学活性与蛋白质含量比值，单位：IU/mg）统一描述。《中国药典》中该品种原液比活性要求大于6.0×107IU/mg。

1.5纯度检测

1.5.1非还原SDS-PAGE

按照《中国药典》三部（2015版）通则0541中第五法———SDS-PAGE法。

1.5.2反相高效液相色谱法

按照《中国药典》三部（2015版）rhG-CSF分论中高效液相色谱法。

1.6等电点检测

按照《中国药典》三部（2015版）通则0541中第六法———等电聚焦电泳法。

1.7N-端氨基酸序列测定

按N-端氨基酸序列分析仪操作规程进行检测。

1.8质谱分子量检测

用超纯水将供试品溶液稀释至约1mg/mL，经超高效液相色谱系统分离后进行质谱仪检测。色谱条件：色谱柱为C4；柱温：80℃；样品池温度：10℃；上样量：1μL；流动相A：超纯水；流动相B：乙腈；流动相C:1%甲酸水溶液。洗脱梯度：0.00→1.00min(A:85%,B:5%,C:10%，流速：0.4mL/min);1.00→8.00min(A:85%→40%,B:5%→50%,C:10%，流速：0.2mL/min),8.00→9.00min(A:40%→0,B:50%→100%,C:0，流速：0.4mL/min）。质谱设定条件：MS模式采集数据；毛细管电压：3000V;Cone电压：40V；去溶剂气体温度：350℃；源温：120℃；去溶剂气体流速：800L/h，扫描范围（m/z):500～3000[4]。rhG-CSF的理论分子量从蛋氨酸起始为18798.56，从苏氨酸起始为18667.36，以±1区间作为可接受范围。

1.9液质肽图和二硫键分析

取100μL约2mg/mL样品，用超纯水2倍稀释，加入Glu-C蛋白酶10μL,37℃孵育18h后，上超高效液相色谱系统C18色谱柱，并用质谱仪进行检测和分析。色谱条件：色谱柱为C18；柱温：40℃；样品保存温度：10℃；流速：0.2mL/min；上样量：20μL。流动相A：超纯水；流动相B：乙腈；流动相C:1%甲酸水溶液。梯度洗脱：0.0→60.0min(A:89%→30%,B:1%→60%,C:10%);60.0→61.0min(A:30%→0,B:60%→90%,C:10%);61.0→65.0min(A:0,B:90%,C:10%）。质谱条件：MSE模式采集数据；毛细管电压：3000V;Cone电压：40V；去溶剂气体温度：350℃；源温：120℃；去溶剂气体流速：800L/h，扫描范围（m/z):50～2000。校正仪器后按程序进行分析[4]。

2、结果

2.1rhG-CSF理化对照品的比活性

所有生产企业rhG-CSF理化对照品的比活性均大于6.0×107IU/mg，大致范围在（6.0～12.0）×107IU/mg之间，平均值为8.9×107IU/mg，标准差为1.92×107IU/mg。见表1。

2.2rhG-CSF理化对照品的纯度

非还原SDS-PAGE分析显示，各批次对照品的纯度均接近100%；但从RP-HPLC纯度结果来看，除6号样品外，似乎均存在纯度与比活性相关的趋势。见表1。

2.3rhG-CSF理化对照品的等电点

多数样品均有不止一条区带，且未发现比活性的高低与区带多少有明显相关性，具体是否存在联系，需进一步研究。见表1。

2.4rhG-CSF理化对照品的N-端氨基酸序列

本文所列rhG-CSF理化对照品主体均为大肠埃希菌表达系统，但有两种N-端氨基酸序列，其中多数为以蛋氨酸（M）残基起始序列，只有一个企业制品的N-端序列以苏氨酸（T）残基起始序列。见表1。

2.5质谱分子量

rhG-CSF理化对照品的分子量均在可接受范围内。但在质谱分子量图中仍有小部分分子（占比小于5.0%）质量数大于rhG-CSF理论值，见表1。除部分分子可能有基团变化外，还有些分子可能只是由于rhG-CSF加合了部分溶剂分子、离子或其组合形式，在进一步分析中消失了。

2.6液质肽图和二硫键分析

液质肽图各肽段质量数与理论肽段各质量数相符，覆盖率接近100%；二硫键链接的肽段质量数与理论肽段链接方式一致（主体连接方式大于95%）；各肽段二级质谱检测的肽段氨基酸序列与理论肽段氨基酸序列一致，氨基酸覆盖率接近100%。见表1。

表1rhG-CSF理化对照品检测结果

3、讨论

由于保存和稳定性等问题，rhG-CSF理化对照品目前并未设立rhG-CSF理化国家标准品。该对照品检测项目包括制品原液中主药蛋白成分的检测和质谱结构确证，前者包括比活性（≥6.0×107IU/mg）、蛋白含量（≥0.5mg/mL）、非还原SDS-PAGE纯度（≥95.0%）、反相高效液相纯度（≥95.0%）、等电点（主区带应为5.8～6.6）、N-端氨基酸序列（MTP-LGPASSLPQSFL或TPLGPASSLPQSFLL）；后者包括质谱分子量（应与理论分子量相符）、液质肽图（应与理论肽段相对分子量相符）、二硫键分析（应与理论连接方式一致）。

目前国产rhG-CSF有两种N-端形式，即从蛋氨酸起始，理论分子量为18798.56(C845H1339O243-N223S9根据《中国药典》原子量表）和从苏氨酸起始，理论分子量18667.36(C840H1330O242N222S8根据《中国药典》原子量表）。理论上说，天然人的G-CSF氨基酸序列N-末端不是以蛋氨酸残基起始，N-端的蛋氨酸残基由表达系统引入。

rhG-CSF蛋白质含量的HPLC检测方法在《中国药典》三部（2010版）中还只是列入附录，但在《中国药典》三部（2015版）分论和通则中已列为正式检测方法。在方法的变更同时又有定量标准品的变迁，关于这方面的评价仍在进行中。

从等电点结果来看，生产企业的rhG-CSF理化对照品的等电点区带不止1条；但从质谱结果来看，各生产企业的rhG-CSF理化对照品主体结构是一致的；从SDS-PAGE纯度和RP-HPLC纯度来看，纯度均在96.0%以上；从比活性来看，等电点区带似乎与比活性相关性不大。这提示等电点的不同区带可能与制品的空间构象有关，但又不是构象上的巨大不同，可能只是分子表面原子契合有差异[5,6,7]，且有彼此之间相互转换可能，也许本研究检测到的结果只是其平衡状态或相对稳定的状态。

电喷雾离子化源属于一种较为温和离子化源，在蛋白质溶液去溶剂过程中，伴随着水分的蒸发，溶液中的正离子和负离子均有机会与蛋白质分子发生吸附作用，即电离过程[8,9,10]，该过程既产生正离子也产生负离子[11,12,13]。质谱的正离子检测模式只是用电场选择了电荷总体展现为正的离子，吸附的负离子由于负电荷被中和，展现为不带电荷的中性分子。同理，负离子检测模式也类似。在正离子检测模式下，加和[H+]的加和离子为带正电加和离子主体，因此相对分子质量的计算用携带[H+]的多少和质核比进行，再扣除加和[H+]质量数，即实测相对分子质量-电荷数，而加和[Na+]和[NH4+]的加和离子携带的电荷虽与[H+]相同，但不是加合分子主体，同样按照加和[H+]离子的计算模式，他们的加和后相对分子质量就分别应增加为23-1和18-1，即为22和17。其他加和分子与其相对分子质量数相同，有时可见到加和多个分子或离子的加和分子。常见的加合离子和分子有钠离子、铵离子、水分子、乙腈分子、甲酸分子、乙酸分子和碳酸分子等，这些加合分子在二级质谱等分析手段下不能像修饰分子一样稳定存在，通常只是给质谱分析带来一些困扰。

本研究收集了国内12家生产企业的rhG-CSF理化对照品，从总体上看，各生产企业的rhG-CSF理化对照品质量良好，可在企业质量控制中发挥应有的作用。但仍存在一些值得进一步关注的问题，希望引起生产企业的重视，不断提升该制品质量。

参考文献：

[2]国家食品药品监督管理总局.重组人粒细胞刺激因子[EB/OL].(2017-01-xx).

[4]毕华,陶磊,韩春梅,等.重组人血管内皮生长因子抑制剂理化对照品质控方法及质量标准的建立[J].中国生物制品学杂志,2017,30(8):833-837.

[7]李响,史新昌,范文红,等.重组人促红素异构体唾液酸化程度分析[J].中国药学杂志,2018,53(19):1682-1686.

[8]高方园,张维冰,关亚峰,等.电喷雾离子化源原理和研究进展[J].中国科学:化学,2014,44(7):1181-1194.

刘兰,史新昌,韩春梅,秦玺,陶磊,杨婧清,范文红,饶春明.国内重组人粒细胞刺激因子理化对照品质量情况分析[J].中国生物制品学杂志,2020,33(06):671-675.