化疗是治疗实体肿瘤的重要手段之一.目前的化疗药物普遍存在靶向递送效率低、毒副作用严重、药动学不佳等缺点，导致抗肿瘤治疗效果不理想且不良反应严重[1].二乙氨基硫代甲酸铜[copper diethyldithiocarbamate, Cu(DDC)2]已被证明具有良好的抗肿瘤作用[2,3],结构式如图1所示.现有研究[4,5]表明，Cu(DDC)2不仅具有活性氧(reactive oxygen species, ROS)诱导作用，而且对核因子κB(nuclear factor kappa-B,NF-κB)的表达具有抑制作用.然而，目前Cu(DDC)2的纳米制剂较少，这与Cu(DDC)2本身的水溶性差等性质有关.Cu(DDC)2在水中的溶解度小于1 mg/L,各种表面活性剂对其增溶效果有限[6],无法满足临床的需求.

图1 Cu(DDC)2的化学结构   

纳米给药系统被认为是靶向治疗肿瘤、提高药物疗效、降低毒副作用的有效手段[7].纳米递送系统不仅能提高疏水性药物的水溶性和稳定性，还能降低药物的毒副作用[8].基于Cu(DDC)2 的纳米给药系统主要有3类：(1)基于脂质的纳米给药系统(脂质体等);(2)基于聚合物的纳米给药系统(聚合物纳米粒、白蛋白纳米粒等);(3)基于无机纳米粒子的给药系统(氧化铁、二氧化硅、量子点等).由于这些载体材料的合成方法多样，可实现上述纳米给药系统的多种修饰而改善其性能，已得到广泛的关注和应用.因此，开发制备方法简单可控、包封率高、疗效好的Cu(DDC)2纳米给药系统是目前的主要研究目标之一[9].

1、Cu(DDC)2纳米给药系统的制备方法

1.1 Cu(DDC)2脂质体的制备

用于药物递送的脂质体通常由饱和酰基链和鞘氨醇组成的卵鞘磷脂制备.卵鞘磷脂可以与胆固醇分子相互作用，形成强的分子间氢键，提高脂质体的膜稳定性[10].Cu(DDC)2脂质体的制备通常加入不同的修饰材料以改变脂质体的特性，延长药物在体内的保留时间.Liu等[11]将聚乙二醇化的磷脂(DSPE-mPEG2 000)加入成膜材料中，采用薄膜水化-挤出法制备聚乙二醇化的Cu(DDC)2纳米脂质体.Liu等[12]使用肝癌细胞靶向肽修饰的聚乙二醇化磷脂(DSPE-PEG2 000-SP94)替换常规DSPE-mPEG2 000,通过反向微乳液聚集法和薄膜分散法制备不对称的双层脂质包封Cu(DDC)2,使Cu(DDC)2载药脂质体避免被网状内皮系统(reticuloendothelial system, RES)清除，提高脂质体在体内的循环半衰期.

1.2 Cu(DDC)2聚合物纳米粒的制备

Cu(DDC)2聚合物纳米粒主要通过递送负载Cu2+和双硫仑(disulfiram, DSF)2种纳米颗粒进入体内，在体内发生原位反应生成Cu(DDC)2,从而杀死肿瘤细胞.Zhang等[13]通过制备聚(丙交酯-co-乙交酯)纳米粒，分别负载疏水性药物DSF和亲水性葡萄糖酸铜，达到向体内递送Cu(DDC)2的目的.

1.3 Cu(DDC)2杂化纳米粒的制备

Cu(DDC)2杂化纳米粒通常采用稳定金属离子配体纳米复合物进行制备，主要以不同物质作为Cu(DDC)2杂化纳米粒的稳定剂，通过漩涡制得.Kang等[14]将CuCl2溶液与二乙基二硫代氨基甲酸钠以1∶2的摩尔比使用涡旋器混合，离心去除微量聚集物后，制得以聚乙二醇-聚乳酸(PEG2 000-PLA1 800)为稳定剂的Cu(DDC)2杂化纳米粒.Chang等[9]将CuCl2与二乙基二硫代氨基甲酸钠三水合物以摩尔比2∶1溶于牛血清白蛋白(bovine albumin, BSA)水溶液，离心去除大聚集物后，制得以BSA为稳定剂的Cu(DDC)2杂化纳米粒.

1.4 Cu(DDC)2白蛋白纳米粒

用于制备药物递送系统的白蛋白以BSA为主.BSA以优异的载药量和偶联能力，能递送多种不溶性药物.Zhao等[15]采用化学交联的方法，在高浓度尿素溶液和硼氢化钠中非共价作用减弱，白蛋白的二硫键被裂解，使白蛋白呈线性结构；添加DSF/Cu复合物和瑞戈非尼后加水稀释，亲脂性药物与疏水结构域会相互作用并诱导自组装成白蛋白纳米粒.He等[16]先将CuSO4、二乙基二硫代氨基甲酸酯、BSA分别溶解在水中，再在涡旋状态下将二乙基二硫代氨基甲酸酯和CuSO4滴入BSA溶液中，制得CuET白蛋白纳米粒.

1.5 Cu(DDC)2黑色素纳米粒

黑色素纳米粒(MNPs)主要通过在碱性环境中超声，随后再逐渐调节pH而制得.Shi等[17]制得MNPs后，再加入NaOH调节pH至9.0,加入mPEG5 000-NH2剧烈搅拌后离心，用去离子水洗涤除去未反应的mPEG5 000-NH2后，再与制备好的CuET混合搅拌2 h, 40 ℃孵育1 h, 制得CuET黑色素纳米粒.

2、Cu(DDC)2的抗肿瘤机制

Cu(DDC)2作为潜在的抗肿瘤药物，具有多种抗肿瘤机制(图2).

图2 Cu(DDC)2抗肿瘤机制示意图   

泛素-蛋白酶体系统是维持细胞内蛋白质稳态的主要系统之一.当胞内出现衰老蛋白或残次蛋白时，这些蛋白首先被泛素化，随后通过一系列途径或通路，如p97-核定位蛋白4(unclear localization protein 4, NPL4)-泛素融合降解蛋白1(ubiquitin fusion degradation protein 1, UFD1)通路降解代谢[18].Cu(DDC)2能通过靶向结合NPL4,干扰p97-NPL4-UFD1通路的形成，引起泛素化蛋白在胞内累积、蛋白降解受损，最终诱导细胞凋亡[19].

除了诱导细胞凋亡，Cu(DDC)2可调节氧化还原微环境杀死肿瘤细胞.维护良好的还原性细胞内介质，对于保护重要功能单元免受有害氧化非常必要.这种还原环境可以通过细胞内丰富的硫醇实现，硫醇可以作为还原剂淬灭细胞内异常升高的活性氧.已有研究[20]表明，Cu(DDC)2能氧化许多重要酶中普遍存在的硫醇锌(Ⅱ)位点.Xu等[21]的研究显示，Cu(DDC)2可以绕过硫醇在硫醇锌(Ⅱ)位点周围构建的还原防御，从而导致恶性细胞氧化损伤和死亡.

硫化氢(hydrogen sulfide, H2S)是哺乳动物体内的气体递质.胱硫醚β-合酶(cystathionine-beta-synthase, CBS) 、胱硫醚γ-裂解酶(cystathionine gamma-lyase, CSE)等产生H2S的酶的过表达，能够促进肿瘤细胞增殖[22].Cu(DDC)2不仅通过抑制CBS和CSE来抑制H2S的生物合成，还直接与H2S反应，通过降低H2S的水平抑制结肠癌细胞的增殖[23].

近年来的研究显示，Cu(DDC)2不仅可以通过多种机制抑制肿瘤细胞，还能通过调节免疫细胞，起到抗肿瘤免疫治疗作用.肿瘤相关巨噬细胞(tumor-associated macrophage, TAM)是影响肿瘤生长的主要免疫细胞群，具有高度可塑性.TAM分为抗肿瘤的Macrophage 1(M1)型和促肿瘤的Macrophage 2(M2)型[24].肿瘤微环境中以M2型TAM为主，将M2型TAM转变为M1型TAM可显著改善肿瘤免疫微环境，增强抗肿瘤免疫治疗.有研究[15]证实，Cu(DDC)2和瑞戈非尼联用可对TAM向M1型极化产生协同作用，其中Cu(DDC)2可能通过增加胞内ROS水平来促进M2型TAM向M1型TAM的转化.

3、Cu(DDC)2的纳米给药系统

常见的Cu(DDC)2 纳米给药系统主要有脂质体、纳米粒等.这些给药系统能够通过被动或者主动靶向聚集至肿瘤部位，增加Cu(DDC)2 溶解度的同时，提高其靶向性和抗肿瘤药效，并减少其毒副作用.本文通过不同载体介绍典型的Cu(DDC)2 纳米给药系统(表1).

表1 Cu(DDC)2纳米给药系统

3.1 Cu(DDC)2脂质体

脂质体由Bangham于1965年提出，并于20世纪70年代首次用作药物载体.脂质体由磷脂和胆固醇组成，可以在同一系统中提供亲水和亲脂环境，用于封装多种药物.脂质体作为药物递送系统，具有生物相容性好、载药量高、靶向性好、毒性低等优势[33].

孔艺涵等[25]通过反相微乳聚合-薄膜水化法成功制备了Cu(DDC)2纳米脂质体，制备得到的脂质体粒径分布均匀，包封率约为74%,冻干后的复溶性能良好.该研究不仅为Cu(DDC)2的注射给药途径提供基础，而且为油水均难溶药物的纳米制剂提供了有益的研究基础.

Cu(DDC)2载药脂质体除了直接将Cu(DDC)2包封于脂质双分子层外，还可以采用间接分步载药法制得.Liu等[11]首先制备了基于鞘磷脂(sphingomyelin, SM)的聚乙二醇化含Cu2+脂质体，然后将DDC添加到含Cu2+脂质体中，使DDC与Cu2+反应合成Cu(DDC)2,最终制得聚乙二醇化的Cu(DDC)2载药脂质体.该脂质体不仅有效提高了Cu(DDC)2的水溶性，而且Cu(DDC)2脂质体的包封率达90%以上.结果表明，Cu(DDC)2脂质体能够在较低浓度下有效抑制4T1乳腺癌细胞的增殖，并在较短的治疗时间内检测到细胞内ROS水平的升高.以4T1乳腺癌小鼠为肿瘤模型，静脉给药Cu(DDC)2脂质体能有效抑制肿瘤生长，抑制率达77.88%.

Wehbe等[27]以二硬脂酰基卵磷脂(1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine, DSPC)/胆固醇为膜材，通过在脂质体内的水相中合成Cu(DDC)2的方法，制得一种可注射的Cu(DDC)2脂质体.体内药效结果显示，在F98神经胶质瘤大鼠模型中，与对照组相比，Cu(DDC)2脂质体组的中位生存期增加了25%;在小鼠皮下MV-4-11模型中，与对照组相比，Cu(DDC)2脂质体组的肿瘤体积减小45%.

近年来，脂质体领域的研究逐渐转向开发能够特异性识别靶细胞的递药系统.这一策略被称为主动靶向，它通过识别细胞表面过度表达的特定分子，从而实现纳米系统在靶细胞上的精准“驱动”[34].修饰脂质体来达到主动靶向的材料有很多.例如，透明质酸(hyaluronic acid, HA)能够靶向识别多种细胞系中过表达的CD44受体.Marengo等[28]制得HA修饰的Cu(DDC)2载药脂质体，该载药脂质体的包封率达91.4%.冷冻透射电镜结果显示，该载药脂质体的内水相中存在Cu(DDC)2晶体.以胰腺癌细胞系和患者胰腺癌干细胞(cancer stem cell, CSC)为细胞模型的体外实验结果显示，HA修饰的Cu(DDC)2脂质体具有高ROS介导的抗肿瘤活性，对CSC细胞的抗增殖能力显著提高.

脂质体技术或脂质体中形成的活性复合物虽已被用于制备可注射的Cu(DDC)2制剂，但Cu(DDC)2物理包封制备的脂质体的载药量往往较低.更重要的是，该方法的制备和纯化过程较为复杂，且生产成本较高.若要用于大规模生产载药Cu(DDC)2脂质体，仍需克服一些挑战.

3.2 Cu(DDC)2纳米粒

3.2.1 Cu(DDC)2聚合物纳米粒

聚合物纳米载体是由天然大分子材料或合成的聚合物材料通过简单工艺制备而成.作为使用最广泛的药物载体之一，聚合物纳米载体具有药物包封率高、稳定性好、药物释放可控制、保护药物不被体液和酶破坏等优点[35].Zhang等[13]采用聚乳酸-羟基乙酸共聚物[poly(lactic-co-glycolic acid), PLGA]纳米粒分别包载双硫仑和葡萄糖酸铜，将2种载药纳米粒经腹腔注射于荷瘤裸鼠体内.PLGA纳米粒释放的双硫仑和Cu2+可在体内形成Cu(DDC)2复合物.该策略避免了Cu(DDC)2复合物沉淀的包封问题，发挥了较好的化疗效果，对间皮瘤表现出良好的抗癌活性.

上述Cu(DDC)2聚合物纳米粒(NPs)均通过被动靶向肿瘤组织发挥抗肿瘤作用.为了提高药物的靶向效率，研究者对Cu(DDC)2 NPs进行了靶向基团的修饰，使其具备主动靶向功能.Peng等[29]通过Cu2+和聚乙二醇-b-聚碳酸酯嵌段共聚物中羧基之间的配位策略制备了高度稳定的聚合物纳米粒子，以有效负载由DSF和Cu2+原位反应生成的Cu(DDC)2.这些载有Cu2+/DDC的纳米粒子在中性和弱酸性溶液，以及稀释条件下均表现出色的稳定性.体外抗癌研究结果表明，Cu2+/DDC纳米粒可以实现基于Cu(DDC)2的化疗和Cu2+介导的化学动力学疗法的联合治疗；体内抗肿瘤结果可知，Cu2+/DDC纳米粒显示出优于DSF/Cu2+的抗肿瘤效果.

3.2.2 Cu(DDC)2杂化纳米粒

除了用有机聚合物制备Cu(DDC)2纳米粒，研究人员还以聚合物和金属框架复合材料对Cu(DDC)2进行负载.Kang等[14]开发了一种以稳定的金属离子配体复合物为载体，制备Cu(DDC)2纳米粒的方法，该纳米粒可有效增敏耐药性前列腺癌和非小细胞肺癌细胞.临床前的动物研究证明了该纳米粒对用紫杉醇抗性前列腺癌细胞建立的异种移植肿瘤的体内抗癌活性.研究还表明，Cu(DDC)2 NPs不是P-糖蛋白(P-glycoprotein, P-gp)的底物，它可以通过避免 P-gp介导的药物外排来克服耐药性，同时不会干扰 P-gp的正常功能.Cu(DDC)2 NPs的这一特性将使其成为耐药前列腺癌的理想治疗剂，并可避免与非选择性P-gp抑制相关的副作用.

Chang等[9]设计了一种3D打印的微流体装置，解决了制备工艺复杂、成本高的难题.制得的牛血清白蛋白修饰的Cu(DDC)2金属有机纳米粒(metal-organic nanoparticle, MON),具有小粒径和窄分布的优点，在血清和长期储存期间表现出优异的稳定性.仿生白蛋白修饰的Cu(DDC)2 MONs的主动靶向性依赖于癌细胞表面过表达的白蛋白结合受体(酸性富含半胱氨酸受体SPARC).体内外的药效实验结果显示，BSA/Cu(DDC)2 MONs在乳腺癌细胞及其3D肿瘤球中显示出良好的抗肿瘤活性，并且能有效抑制原位4T1乳腺肿瘤的生长.

3.2.3 Cu(DDC)2白蛋白纳米粒

白蛋白用来运输血液中不同的内源性分子.白蛋白因其优异的载药/偶联能力和固有的转运体特性，经常被用于制备仿生纳米级传递载体[36].而且，白蛋白是能量和营养的主要来源，许多肿瘤对白蛋白的需求量很大.因此，肿瘤细胞吸收白蛋白的能力相对正常细胞会更强[37],这一特征可用于白蛋白的肿瘤靶向递送.

Zhao等[15]利用尿素/硼氢化钠使牛血清白蛋白变性，添加疏水性药物并稀释盐浓度诱导自组装，形成Cu(DDC)2白蛋白纳米粒，再用甘露糖修饰，实现半胱氨酸和甘露糖转运蛋白高表达的耐药结肠癌细胞和原发性M2巨噬细胞的协同双靶向递送.实验结果表明，该载药白蛋白纳米粒可以高效抑制HCT8/ADR细胞增殖，并显著改善对耐药性肿瘤动物模型的疗效.

3.2.4 Cu(DDC)2黑色素纳米粒

黑色素是一种天然的色素，广泛存在于各生物体中，能够吸收光能并转化成相应的热能.黑色素在近红外区具有良好的吸收性和较高的光热转换效率，可被选作仿生纳米粒或修饰纳米粒的材料.因此，黑色素纳米粒不仅具有良好的生物相容性和生物安全性，而且能够结合光热疗法杀死癌细胞，同时触发药物释放，有效抑制肿瘤的生长[38].

Shi等[17]通过疏水相互作用制备了载有Cu(DDC)2的超小黑色素纳米粒，显著提高了Cu(DDC)2的水溶性.体内结果显示，Cu(DDC)2超小黑色素纳米粒在小鼠肿瘤模型中显示良好的肿瘤部位聚集性和优异的肿瘤抑制能力；Cu(DDC)2超小黑色素纳米粒组的肿瘤生长抑制率为45.1%,结合光热疗法后的肿瘤生长抑制值可提升至78.6%.

4、Cu(DDC)2的共载纳米给药系统

近年来，研究人员将Cu(DDC)2和其他抗肿瘤药物共同装载于递药系统中，得到Cu(DDC)2共载纳米系统，进一步提高Cu(DDC)2纳米给药系统的抗肿瘤能力.相比于单一负载Cu(DDC)2递药系统，Cu(DDC)2共载系统表现出更好的抑制肿瘤生长作用.

Li等[39]将载铁蛋白开发为Cu(DDC)2载体，解决Cu(DDC)2的水溶性差和非特异性毒性的问题，载铁蛋白在载药纳米粒制备中表现出优于人血清白蛋白的稳定性和保护性.研究结果显示，该共载脂质体具有出色的抗肿瘤效率(>97%),谷胱甘肽反应结果显示了该共载脂质体联合治疗肿瘤的潜力. Xu等[30]将阿霉素和Cu(DDC)2封装到层状双氢氧化物中，通过静电吸附作用在纳米粒上包裹PEG-PLG,有效提高了载药纳米粒的稳定性；进一步采用HA修饰纳米粒，有效增强肿瘤特异靶向性的同时，实现了对难治性肝癌的协同治疗.

5、前景和展望

体内外的研究表明，Cu(DDC)2纳米给药系统可以改善Cu(DDC)2的抗肿瘤作用.药物从普通纳米给药系统中释放主要依靠药物分子自身扩散或纳米给药系统的自身降解，存在药物释放缓慢和不完全.刺激响应性纳米给药系统可以将药物递送到肿瘤部位，被包载的药物聚集至肿瘤部位后，再响应刺激源使药物得以快速释放，在提高抗肿瘤药化疗效果的同时，明显减少毒副作用.今后可以考虑开发刺激响应性Cu(DDC)2纳米给药系统.

目前，关于Cu(DDC)2响应性纳米给药系统治疗肿瘤的研究还较少.具有上临界溶解温度的聚合物纳米给药系统具有潜在的研究价值.聚合物纳米给药系统在低于聚合物的上临界溶解温度时，聚合物实现Cu(DDC)2的有效包载，减少渗透和毒副作用；在高于聚合物的上临界溶解温度时，聚合物的疏水链段转变成亲水链段，导致整个聚合物解体，实现Cu(DDC)2的快速完全释放.随着研究的不断深入，基于生理机制并更加智能化的Cu(DDC)2纳米给药系统相信会被进一步开发，并应用于肿瘤治疗领域.

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基金资助:浙江省医药卫生科技计划青年人才项目(2022RC241);浙江省医药卫生科技计划一般项目(2024KY236);国家级大学生创新创业训练计划项目(202310346080);2023年杭州师范大学教学改革项目;

文章来源:潘雪飞,王劲,陈晓蕾等.Cu(DDC)2纳米给药系统的抗肿瘤研究进展[J].杭州师范大学学报(自然科学版),2024,23(02):124-131.