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摘要:癌症威胁着人类健康,全球范围内胃癌和结直肠癌仍是癌症相关死亡的主要原因之一。早期诊断对提高胃癌和结直肠癌的生存率尤为重要,但目前的临床筛查手段都具有一定的局限性。近来液体活检(fluid biopsy)得到了研究者的广泛关注,其中循环肿瘤DNA(circulating tumor DNA,ctDNA)是体液内肿瘤来源的游离DNA片段,携带肿瘤相关遗传信息,目前已有相关研究表明ctDNA检测在胃癌和结直肠癌的早期诊断中具有特异性。该文主要就ctDNA及其在胃癌和结直肠癌早期诊断中的应用进展予以综述。
目前,癌症仍然是威胁人类健康的重要因素。据统计,全球范围内胃癌的发病率排名第五,死亡率排名第四,而结直肠癌发病率排名第三,死亡率排名第二,仅次于肺癌[1]。近年来,尽管胃癌和结直肠癌的诊断和治疗方法有了新的进展,但患者的预后仍不理想[2]。胃癌和结直肠癌起病隐匿,早期临床症状常缺乏特异性,多数患者发现时已 处于 疾病中晚期,错失了最佳的治疗时机,因此早期诊断和治疗极为重要。目前,一些肿瘤标志物应用于胃癌和结直肠癌的早期筛查,但总体敏感性和特异性较低[3]。组织活检病理仍然是诊断的金标准,然而侵入性操作存在风险,肿瘤异质性容易造成取样偏差,患者依从性差等使内镜检查具有一定局限性。液体活检作为一种检测体液中的微小肿瘤物质的体外诊断技术,近来得到了广泛的关注。液体活检主要识别外周血的循环成分,包括循环肿瘤细胞(circulating tumor cells, CTCs)、循环肿瘤DNA(circulating tumor DNA,ctDNA)、细胞外囊泡(extracellular vesicles, EVs)以及循环肿瘤RNA(circulating tumor RNA,ctRNA)等[4]。其中,与ctDNA相比,CTCs在外周血中浓度较低且具有脆性,ctRNA的稳定性较低,半衰期更短,而对于EVs尚未形成成熟的高效分离手段。因此,本文主要就ctDNA及其在胃癌和结直肠癌早期诊断中的应用进展予以综述。
1、胃癌和结直肠癌早期诊断的临床意义
肿瘤的分期决定了治疗效果和治疗策略。早期胃癌患者行根治性手术及术后化疗,5年生存率高达90%,但由于早期胃癌缺乏特异性征象,检出率低,因此大多数患者(>70%)发展为晚期疾病[5]。研究显示,在亚洲人群中,内镜检查可使胃癌死亡率降低40%,且不影响胃癌的发病率[6]。
结直肠癌患者的5年相对生存率为65%,直肠癌(67%)略高于结肠癌(64%)。在20%诊断为I期患者和22%诊断为II期的患者中,5年相对生存率分别为91%和82%。然而,IV期疾病的5年生存率下降到12%[7]。在过去20年里,美国50岁及以上成年人的结直肠癌发病率和死亡率呈持续下降趋势,这在很大程度上归功于早期筛查[8]。美国癌症学会强烈建议50岁以上的成年人进行结直肠癌常规筛查,可供选 择的方案有:每年进行粪便免疫化学试验(FIT)、每年进行高敏感性 粪便隐血试验(HSgFOBT)、每3年进行多靶点粪便DNA试验(mt-sDNA)、每10年进行结肠镜检查、每5年进行CT结肠镜检查(CTC)或每5年进行柔性乙状结肠镜检查(FS)[9]。
2、ctDNA的研究进展
2.1 ctDNA概述
1948年,MANDEL和MEATIS[10]首次报道了血液中存在游离DNA(cell-free DNA,cfDNA)。1977年,LEON等[11]发现肿瘤患者较健康人群血清中cfDNA水平明显升高。LO YM等[12]报道孕妇血浆中含有高浓度的胎儿DNA。1989年,STROUN等[13]证实部分血浆cfDNA来源于肿瘤细胞。1994年,SORENSON等[14]首次在胰腺癌患者cfDNA中检测到KRAS突变,并验证了其来源于肿瘤细胞。随着相关研究的不断深入,人们发现在主要来源于正常组织的cfDNA中存在小部分游离DNA片段,其由肿瘤原发灶和转移灶或循环肿瘤细胞凋亡及坏死后释放入血,这就是ctDNA[15]。ctDNA也可以在非血液性体液,如尿液、唾液、痰液、粪便、胸膜液和脑脊液中检测到[16]。目前已证实ctDNA携带有与其来源的肿瘤细胞相同的遗传信息,包括点突变、甲基化、重排、单核苷酸变异和基因拷贝数变异等[17,18],并被肿瘤细胞连续释放,通过血液核酸酶的降解,最终 被肝脏和肾脏清除,半衰期在16分钟到2.5小时之间[19],这使其动态反映肿瘤相关信息成为可能。
2.2 ctDNA的检测方法
目前,ctDNA的检测方式可大致分为两大类:基于聚合酶链反应(polymerase chain reaction, PCR)的检测和基于下一代测序(next-generation sequencing, NGS)的检测。
2.2.1基于PCR的检测
微滴式数字聚合酶链反应(droplet digital PCR,ddPCR)将血浆样品离散成众多微滴,使每个微滴只含模板DNA的一个片段,运用PCR扩增后,通过分析每个微滴的片段序列,检测目标突变[20]。其优点在于成本低、速度快、灵敏度高,可以检测的变异等位基因频 率(variant allele frequency, VAF)≤0.01%[21],不需要大量样本就可以实现绝对定量。
磁珠乳液扩增法(beads, emulsion, amplification, and magnetics, BEAMing)将PCR过程分成几个独立的反应以实现对稀有DNA序列的高分辨检测。在此过程中,样本中的每一个DNA分子都与单独的含有特异的PCR引物磁珠相结合,分散至油包水的乳液中,使每一乳液仅包含一个DNA分子模板,并运用PCR进行扩增,然后应用流式细胞术来评估原始DNA分子群体中的变异[22]。
由定量PCR演变成的扩增阻滞突变系统聚合酶链反应(amplification refractory mutation system PCR,ARMS-PCR)可以检测到低至0.01%的突变DNA样本的已知突变[23]。
除此之外还有数字聚合酶链反应(digital PCR,dPCR)、实时荧光定量聚合酶链反应(quantitative real-time PCR,qRT-PCR)、甲基化特异性聚合酶链反应(methyl-specific PCR,MSP)等。
2.2.2基于NGS的检测
在基于NGS的检测中,常用的靶向测序平台包括标记扩增深度测序(tagged-amplicon deep sequencing, TAm-Seq)、安全测序系统(safe-sequencing system, Safe-SeqS)和肿瘤个体化深度测序分析(cancer personalized profiling by deep sequencing, CAPP-Seq)。可以检测大量未知突变,但相对成本高而且耗时长。而全外显子组测序(whole-exome sequencing, WES)和全基因组测序(whole-genome sequencing, WGS),因为灵敏度和成本限制相对并不常用。
3、ctDNA检测在胃癌和结直肠癌早期诊断中的应用
目前,已有多项研究表明胃癌和结直肠癌患者血浆中cfDNA及ctDNA水平与健康人群有明显差异。PARK等[24]发现胃癌患者与年龄匹配的健康组相比,血浆cfDNA平均水平高2.4倍,提示 血浆cfDNA水平可能对胃癌患者具有预测作用。研究者运用qRT-PCR方法比较受试者血浆中的cfDNA,发现健康对照组、早期胃癌患者、进展期胃癌患者cfDNA的平均水平分别为(79.78±8.12)ng/mL、(106.88±12.40)ng/mL、(120.23±10.08)ng/mL,当临界值为90 ng/mL时,敏感性为96.67%,特异性为94.11%[25]。QIAN等[26]采用Alu-qPCR检测124例胃癌患者、64名胃良性病变患者和92名健康对照,结果发现I期胃癌患者的cfDNA浓度显著高于胃良性病变患者和健康对照组,绝对值约为健康对照组的6倍,cfDNA在I期胃癌患者检测中也比传统的肿瘤生物标志物更敏感,包括癌胚胎抗原、糖类抗原19-9、CA50和CA72-4、糖类抗原125、糖类抗原50。一项meta分析[27]显示,ctDNA检测诊断胃癌的敏感性和特异性分别为62%和95%。研究证实ctDNA与五种常用肿瘤标志物(癌胚抗原、甲胎蛋白、糖类抗原19-9、糖类抗原125、糖类抗原72-4)相比,对于各分期的结直肠癌均有更强的检测能力[28]。
肿瘤的表观遗传学改变常在疾病早期发生,而DNA甲基化是人类癌症中最常见的表观遗传学变化之一,它为癌症发生提供了重要信息。目前已发现约70个甲基化启动子区域可能作为结直肠癌筛查的血液或粪便生物标志物[29],部分已经商业化,用于早期结直肠癌检测,如Epi proColon 2.0、ColoSure和Cologuard。其中SEPT9是研究最广泛的标志物,因为它在细胞从腺瘤向癌的转变中起着关键作用。CHURCH等[30]在一项包含7 941名参与者(45%男性和55%女性)的前瞻性试验中发现,53例结直肠癌患者和1 457例非结直肠癌患者的SEPT9基因甲基化筛查结果标准化敏感性为48.2%,分期I-IV期的敏感性分别为35.0%、63.0%、46.0%和77.4%,特异性为91.5%。一项meta分析[31]显示,对于结直肠癌患者,SEPT9基因甲基化检测的敏感性和特异性为71%和92%,在晚期结直肠癌(I组45%,II组70%,Ⅲ组76%,IV组79%)和低分化组织(高分化31%,中分化73%,低分化90%)的阳性率较高。然而有研究者认为,在有症状人群中,SEPT9基因甲基化试验的效果优于血清蛋白标记物和FIT,而在无症状人群中,似乎并没有更优[32]。基于SEPT9基因甲基化检测的Epi proColon2.0已被美国食品和药物管理局批准用于不愿意接受结肠镜和FIT的患者。有研究者将其用于50岁以下人群的 结直肠癌筛查,灵敏度为90.8%,特异性 为88.9%,但样本量较小[33]。研究发现结直肠无病变、良性病变及非进展期腺瘤患者血清NEUROG1基因甲基化水平低,进展 期腺瘤及结直肠癌患者血清NEUROG1基因甲基化水平升高。将血清NEUROG1基因甲基化检测与FIT、年龄和性别相结合,可以检测出进展期腺瘤和结直肠癌[34]。同样的,甲基化TWIST1与FIT联合检测可能成为新的筛查手段[35]。LI等[36]研究发现结直肠患者的cfDNA样本中存在SCTR基因的高甲基化,但在健康对照组中没有发现。近期一项病例对照研究中,研究者发现在未筛选的人群中,结直肠癌临床诊断2年前就可以在其血浆中检测到已知的ctDNA甲基化标志物,其中特异性最高的单一标志物为BMP3、FLI1、IKZF1、SFRP1、SFRP2、NPTX2、SLC8A1和VIM(特异性>70%),将它们组合时,敏感性为43%,特异性为86%[37]。在胃癌的早期检测中,GUO等[38]运用MSP方法分别检测胃癌患者和健康对照外周血p16基因甲基化状态,发现胃癌外周血样本中p16的甲基化比例明显高于对照组。PIMSON等[39]发现202例胃癌患者血浆ctDNA中PCDH10和RASSF1A的高频率甲基化分别为94.1%和83.2%,而在202个匹配对照中为2.97%和5.45%。另外,有研究者发现ZIC1、HOXD10和RUNX3的甲基化率在胃癌发生的进程中显著增加[40]。REN等[41]使用基因组规模DNA甲基化分析方法(MCTA-Seq)鉴 定了153种cfDNA甲基化生物标志物,包括DOCK10、CABIN1和KCNQ5,其对胃癌I至IV期的敏感性分别为44%、59%、78%和100%,特异性为92%。
在一项包含260例新近诊断为结直肠癌、胃癌、胰腺癌、肝癌或甲状腺癌的患者和90名健康 受试者的试验中,研究者在cfDNA中发 现了癌症相关的5-羟甲基胞嘧啶(5-hydroxymethylcytosine, 5hmC)特征,并且提出cfDNA中5hmC生物标志物对结直肠癌和胃癌的预测能力很强,优于传统生物标志物,与组织活检的5hmC生物标志物具有可比性[42]。
许多癌症的发生与体细胞突变有关,而ctDNA也携带相关突变信息。KOPRESKI等[43]前瞻性地收集了240例接受结肠镜检查的患者的血浆样本,结果发现在有组织样本可供比较的135例患者中,35例患者的组织中发现K-ras基因突变,这其中29例(83%)在血浆样本中发现突变,而在未做活检的105例患者中,有28例患者血浆DNA发现K-ras基因突变。64例血浆DNA突变的患者中有25例(39%)确诊为存在K-ras突变的结直肠癌患者,176例血浆DNA无K-ras基因突变的患者中有5例(3%)确诊。由此可见,血浆DNA检测K-ras基因12密码子突变可能成为筛选结直肠癌的一种可行的方法。在转移性结直肠癌患者中,cfDNA检测对BRAF V600E突变的特异性及敏感性均为100%,而对7个被检测的K-ras点突变,特异性为98%,敏感性为92%[44]。LYU等[45]利用PCR/SERS检测结直肠癌患者ctDNA中3个DNA点突变位点,包括KRAS G12V、KRAS G13D和BRAF V600E,并通过ddPCR进一步验证,结果具有较高的敏感性和特异性,且与病理检测结果吻合较好。除了基因点突变,一些基因拷贝数变异也能在ctDNA中检测到,SHODA等[46]通过ddPCR分别检测胃癌手术患者及健康志愿者的血液样本,结果发现胃癌患者术前血浆HER2比值与肿瘤HER2状态相关(P<0.001),敏感性为73.3%,特异性为93.3%。同时,通过qPCR评估的肿瘤组织中HER2基因拷贝数高的患者,在液体活检中表现为HER2基因拷贝数高的可能性明显更大[47]。
4、小结与展望
与传统体液检测方法相比,ctDNA检测具有更高的敏感性和特异性,能更好地为胃癌和结直肠癌早期诊断提供依据,特别是在临床症状不典型的患者中。与传统组织学检测相比,ctDNA检测具有非侵入性、可重复性、实时动态等优点,能在一定程度上克服肿瘤异质性,更全面地反映整体。其临床应用限制性较小、风险较低,对于一些临床上难以进行组织活检的患者,具有更高的应用价值。另一方面,ctDNA检测可选择的靶点众多,因此具有广阔的研究前景。
但目前ctDNA检测仍然存在着一些问题。首先,现有的研究多为实验室范围的小样本研究,需要更多的前瞻性、大样本、多中心的人群试验加以验证。其次,实验中的各个环节,包括样本的提取、运输、储存及ctDNA的检测方法等,尚无统一的行业标准。再次,早期诊断对胃癌和结直肠癌的患者来说获益更多,但早期肿瘤患者血液内ctDNA浓度较低,容易导致检测结果假阴性,另一方面,外伤、缺血、感染或炎症等一些情况也会导致外周血ctDNA升高[48]。研究发现,非肿瘤造血干细胞产生的DNA片段可能混淆ctDNA检测,导致假阳性结果[49]。最后,目前各项研究结果敏感性和特异性差异较大,对应的ctDNA检测方法缺乏可靠性和稳定性,这限制了其真正应用于临床检测。
美国临床肿瘤学会(American Society of Clinical Oncology, ASCO)和美国病理学家学会(College of American Pathologists, CAP)在一篇联合综述[50]中指出,在临床试验之外,尚无临床有效性和临床效用的证据支持ctDNA检测可以应用于癌症筛查。然而,在同年的ASCO年会上报告的许多研究成果都支持ctDNA检测对于胃肠道恶性肿瘤患者具有价值[51]。
近期多项研究利用靶向DNA甲基化检测,从大量目标基因中进行筛选,构建出多基因甲基化检测模型,由此大大提高了包括早期阶段在内的各阶段肿瘤的检出率,这将为解决ctDNA检测对于早期胃癌和结直肠癌敏感性较低的问题提供新思路[52,53,54]。EpiPanGI Dx是一种基于差异甲基化区域的泛胃肠道诊断检测,在预测六种不同胃肠道肿瘤的起源组织时显示出强大的诊断准确性,对大多数胃肠道癌症的预测准确度为85%~95%[55]。一些研究者发明了名为“CancerSEEK”的新型癌症血液检测方法,通过评估循环蛋白水平和细胞游离DNA突变,对于八种常见癌症,包括卵巢癌、肝癌、胃癌、胰腺癌、食管癌、结直肠癌、肺癌和乳腺癌,均具有早期识别能力。这预示着联合检测在一定程度上能突破单独ctDNA检测的局限性[56]。而一种全新开发的基于血液cfDNA全基因组片段化丰度谱的检测方法(DNA evaluation of fragments for early interception, DELFI),可以在个体中评估基因组中数百万个天然存在的cfDNA片段的大小分布和频率,由此识别循环中的大量肿瘤衍生变化,为无创诊断提供了新的思路[57]。
随着精准医疗时代的到来,人们致力于寻找更便捷而有效的疾病诊断方式,而ctDNA检测作为液体活检的重要组成部分,有望成为新的“肿瘤标志物”。虽然其应用于临床之前仍有很多问题亟待解决,但不可否认的是,ctDNA检测在癌症早期诊断方面具有巨大的潜力,相信在不久的将来,更多ctDNA检测方法能应用于胃癌和结直肠癌的早期诊断。
文章来源:单逸凡,戴一扬.循环肿瘤DNA在胃癌和结直肠癌早期诊断中的应用进展[J].现代肿瘤医学,2024,32(15):2915-2920.
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肺癌是我国临床上比较常见的一种恶性肿瘤疾病,其发病率和死亡率均位居恶性肿瘤疾病的首位,非小细胞肺癌是肺癌的一种,它的种类有肺鳞癌、肺腺癌以及肺大细胞癌,与其他种类小细胞肺癌相比,它的癌细胞具有生长速度慢、分裂速度较缓慢以及扩散转移主要发生在晚期等特点。
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期刊名称:现代肿瘤医学
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主管单位:陕西省科学技术协会
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出版地方:陕西
专业分类:医学
国际刊号:1672-4992
国内刊号:61-1415/R
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创刊时间:1993年
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