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老年直肠癌患者EGFR、MMP-2、BRCA1、mTOR表达及临床意义

2024-05-04 54 上传者：管理员

摘要：目的探讨老年直肠癌患者表皮生长因子受体(EGFR)、基质金属蛋白酶(MMP)-2、乳腺癌1号基因(BRCA1)、雷帕霉素靶蛋白(mTOR)表达变化及临床意义。方法选取老年直肠癌患者92例为直肠癌组；另收集同期健康志愿者40例为健康对照组。酶联免疫吸附试验测定两组血清EGFR、MMP-2浓度。收集老年直肠癌患者直肠癌组织和癌旁正常组织，免疫组化检测BRCA1、mTOR蛋白表达。收集两组性别、年龄及老年直肠癌患者临床病理特征。随访3年，记录患者生存情况，分为生存组和死亡组。结果直肠癌组血清EGFR、MMP-2水平明显高于健康对照组(P<0.01)。直肠癌组织中BRCA1阳性率明显低于癌旁正常组织，mTOR阳性率明显高于癌旁正常组织(P<0.001)。血清EGFR、MMP-2浓度及组织中BRCA1、mTOR阳性率在不同TNM分期、淋巴结转移、远处转移、分化程度的老年直肠癌患者间差异有统计学意义(P<0.01);血清EGFR、MMP-2浓度及组织中BRCA1、mTOR阳性率在不同肿瘤直径的老年直肠癌患者间差异无统计学意义(P>0.05)。死亡组血清EGFR、MMP-2浓度及组织中mTOR阳性率明显高于生存组，BRCA1阳性率明显低于生存组(P<0.01)。受试者工作特征(ROC)曲线分析显示，EGFR、MMP-2、BRCA1、mTOR对老年直肠癌患者预后均具有较高的评估价值(P<0.01);其中各指标联合检测对老年直肠癌患者预后的评估价值最高[曲线下面积(AUC)=0.953]。结论老年直肠癌患者血清EGFR、MMP-2浓度和肿瘤组织中mTOR表达水平明显升高，肿瘤组织中BRCA1表达水平明显降低，且与临床病理特征明显相关，联合检测可用于患者预后评估。

关键词：
乳腺癌1号基因
基质金属蛋白酶-2
直肠癌
表皮生长因子受体
雷帕霉素靶蛋白
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直肠癌的发病率位居消化道恶性肿瘤第3位，约占胃肠道恶性肿瘤的26%,死亡率超过60%[1]。老年人群是直肠癌的高发群体，流行病学研究显示，新发直肠癌患者中75岁以上人群约占35%[2,3]。近年来癌症治疗技术取得了快速发展，外科手术、药物治疗水平明显提高，直肠癌患者预后也随之改善，但不同患者预后仍存在较大差异，准确评估预后对治疗方案的合理制定具有重要参考价值。表皮生长因子受体(EGFR)与肿瘤细胞生长、修复等过程密切，参与结直肠癌的发生与发展[4]。在结直肠癌、非小细胞肺癌等恶性肿瘤患者中均发现基质金属蛋白酶(MMP)-2高表达，且与病情严重程度呈正相关[5,6]。目前关于乳腺癌1号基因(BRCA1)在乳腺癌病情发展中作用的研究较多，但在直肠癌患者中作用的研究仍较为少见[7]。雷帕霉素靶蛋白(mTOR)是多条信号通路的关键因子，通过磷酸化mTOR在肿瘤发展过程中发挥作用，包括对EGFR表达的影响[8]。本研究旨在探讨老年直肠癌患者EGFR、MMP-2、BRCA1、mTOR表达变化及临床意义。

1、对象与方法

1.1 研究对象

选取2019年1月至2020年3月甘肃中医药大学第四附属医院老年直肠癌患者92例为直肠癌组。入选标准：①年龄≥60岁，符合2017版中国结直肠癌诊疗规范中对直肠癌的诊断标准，经组织病理学检查确诊；②既往无放疗、化疗、免疫治疗、靶向治疗等抗肿瘤治疗史；③理解能力正常，临床资料完整，自愿配合完成随访。排除标准：①有心、肝、肾等重要器官功能严重障碍者；②合并血液系统疾病、自身免疫性疾病、感染性疾病者；③有其他肿瘤或直肠癌复发者。其中男58例，女34例；年龄60～81岁，平均(71.52±5.24)岁。另收集同期健康志愿者40例为健康对照组，男25例，女15例；年龄60～78岁，平均(70.60±4.71)岁。两组性别、年龄间差异无统计学意义(P>0.05),具有可比性。

1.2 标本收集与处理

对照组健康志愿者体检时，抽取清晨空腹外周静脉血放于含乙二胺四乙酸钠的试管中，混合均匀后3 000 r/min离心20 min,离心温度4℃,离心半径12 cm,收集上层血清，-80℃保存用于血清EGFR、MMP-2浓度检测。收集老年直肠癌患者直肠癌组织和癌旁正常组织，常规石蜡包埋制成石蜡包块用于BRCA1、mTOR蛋白表达的免疫组化检测。

1.3 血清EGFR、MMP-2浓度检测

酶联免疫吸附试验测定老年直肠癌和健康志愿者血清EGFR、MMP-2浓度。用纯化的EGFR、MMP-2抗体包被微孔板，制作成为固相抗体，之后向已成功包被抗体的微孔中加入EGFR、MMP-2,再加入辣根过氧化物酶标记的山羊抗人单克隆抗体，形成复合物后滴加显色剂，颜色深浅程度与EGFR、MMP-2表达水平呈正相关，使用酶标仪测定450 nm处的吸光度值，带入标准曲线计算浓度。

1.4 免疫组化检测BRCA1、mTOR蛋白表达

取组织标本石蜡包块，4μm连续切片，放入烤箱中60℃烤片30 min,取出后室温下放置30 min,二甲苯浸泡后梯度浓度的酒精脱水，3%过氧化氢孵育30 min,去除内源性过氧化物酶活性；放入枸橼酸盐抗原修复溶液中95℃修复20 min,加入山羊血清封闭液(10%),室温下静置20 min,封闭非特异性抗原；滴加一抗：鼠抗人BRCA1单克隆抗体(稀释倍数1∶500),鼠抗人mTOR单克隆抗体(稀释倍数1∶800),鼠抗人β-肌动蛋白单克隆抗体(稀释倍数1∶2 000),室温下孵育1 h,滴加辣根过氧化物酶标记的山羊抗鼠IgG(稀释倍数1∶4 000),二氨基联苯胺(DAB)显色、二甲苯透明、中性树胶封片。将切片放于光学显微镜下计数，放大倍数400倍，随机计数200个细胞，计算阳性细胞比例，根据阳性细胞比例和染色强度进行评分。阳性细胞比例：0%～4%(0分)、5%～19%(1分)、20%～49%(2分)、≥50%(3分)。染色强度：无色(0分)、浅棕色(1分)、棕黄色(2分)、棕褐色(3分)。以阳性细胞比例评分与染色强度评分的乘积判定结果，阴性(0分)、弱阳性(1～2分)、中等阳性(3～4分)、强阳性(>4分),将中等阳性和强阳性记为阳性。

1.5 资料收集和随访

收集老年直肠癌患者和健康志愿者的性别、年龄及老年直肠癌患者临床病理指标：TNM分期、淋巴结转移、远处转移、分化程度、肿瘤直径。随访3年，记录患者生存情况，分为生存组和死亡组。

1.6 统计学分析

采用SPSS25.0软件进行单因素方差分析、t检验、χ2检验及受试者工作特征(ROC)曲线分析。

2、结果

2.1 两组血清EGFR、MMP-2水平比较

直肠癌组血清EGFR、MMP-2水平高于健康对照组，差异有统计学意义(P<0.01)。见表1。

表1两组血清EGFR、MMP-2水平比较

2.2 直肠癌组织与癌旁正常组织中BRCA1、mTOR阳性表达情况比较

直肠癌组织中BRCA1阳性率低于癌旁正常组织，mTOR阳性率高于癌旁正常组织，差异有统计学意义(P<0.001)。见表2。

2.3 不同临床病理特征老年直肠癌患者血清EGFR、MMP-2浓度及组织中BRCA1、mTOR阳性表达情况比较

血清EGFR、MMP-2浓度及组织中BRCA1、mTOR阳性率在不同TNM分期、淋巴结转移、远处转移、分化程度的老年直肠癌患者间差异均有统计学意义(P<0.01)。见表3。

表2直肠癌组织与癌旁正常组织中BRCA1、mTOR阳性表达比较[n(%),n=92]

表3不同临床病理特征老年直肠癌患者血清EGFR、MMP-2浓度及组织中BRCA1、mTOR阳性表达比较

2.4 不同预后情况老年直肠癌患者血清EGFR、MMP-2浓度及组织中BRCA1、mTOR阳性表达比较

直肠癌患者中死亡组血清EGFR、MMP-2浓度及组织中mTOR阳性率高于生存组，BRCA1阳性率低于生存组，差异有统计学意义(P<0.01)。见表4。

表4不同预后老年直肠癌患者血清EGFR、MMP-2浓度及组织中BRCA1、mTOR阳性表达比较

2.5 EGFR、MMP-2、BRCA1、mTOR对老年直肠癌患者预后的预测价值

以EGFR、MMP-2、BRCA1、mTOR水平变化评估老年直肠癌患者预后的灵敏度为纵坐标，以1-特异性为横坐标，构建ROC曲线，结果显示，EGFR、MMP-2、BRCA1、mTOR对老年直肠癌患者预后均具有较高的评估价值(P<0.01);其中各指标联合检测对老年直肠癌患者预后的评估价值最高[曲线下面积(AUC)=0.953],灵敏度、阳性预测值均明显高于各指标单独检测。见图1、表5。

图1 EGFR、MMP-2、BRCA1、mTOR对老年直肠癌患者预后预测价值的ROC曲线

表5 EGFR、MMP-2、BRCA1、mTOR对老年直肠癌患者预后的预测价值

3、讨论

直肠癌是临床常见的消化道恶性肿瘤，具有恶性程度高、死亡率高的特点，多发于老年人群[9]。随着近年来肿瘤治疗技术的进步，直肠癌的治疗方案也逐渐多样化，包括手术治疗、放化疗、靶向治疗、免疫治疗等，根据患者病情制定合理的治疗方案是改善临床预后的关键，其中准确评估患者的预后具有重要参考价值[10]。EGFR是一种多功能糖蛋白，广泛分布于人体组织细胞膜表面，活化后可激活下游丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号通路，抑制细胞凋亡和DNA修复，加速细胞侵袭，参与肿瘤的发生与发展[11]。相关研究显示，EGFR参与结直肠癌、乳腺癌等多种恶性肿瘤的发生与发展，与肿瘤细胞生长、修复等过程密切相关[12]。MMPs是一组锌离子依赖性内肽酶，参与细胞外基质和基底膜的降解，可通过MMPs间相互作用和部分细胞活素影响氨基末端区域与半胱氨酸残基、锌离子之间的相互作用，催化降解氨基末端氨基酸片段，转化为具有蛋白水解活性的活性酶状态，降解细胞外基质，参与肿瘤细胞的浸润、转移过程[13]。MMP-2也被称为Ⅳ型胶原酶，是MMPs家族中分布最广的成员，在多种恶性肿瘤细胞中均发现MMP-2高表达，且与肿瘤恶性程度呈正相关[14]。

BRCA基因表达与DNA损伤修复、转录与翻译，染色体稳定性密切相关，其异常表达易导致细胞癌变[15]。BRCA基因包括BRCA1和BRCA2,BRCA1功能包括调节细胞周期、DNA损伤修复、肿瘤生长抑制、基因转录激活等。相关研究显示，BRCA1参与结直肠癌细胞DNA损伤过程，能够调节DNA损失的感受器和效应器，在细胞生长、凋亡调节及DNA修复等细胞周期进展中发挥重要作用，且与肿瘤细胞淋巴结转移和肿瘤临床分期密切相关[16]。mTOR是高度保守的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，存在于mTORC1、mTORC2复合物中，生长因子、能量状态、氨基酸水平、氧水平的改变能够激活mTORC1,调节蛋白质合成、脂质代谢、自噬等多种生物过程[17];此外，由于mTOR、Rictor观察蛋白等组成的mTORC2能够与生长因子相互作用，调控细胞代谢、存活[18]。相关研究显示，mTORC1信号是结直肠癌发生与发展的关键调控因子，其高表达能够促进肿瘤的生长与转移[19]。

本研究结果提示，老年直肠癌患者中EGFR、MMP-2、mTOR高表达，BRCA1低表达，可能与病情的发生、发展相关，另外说明EGFR、MMP-2、BRCA1、mTOR与老年直肠癌患者的临床病理特征密切相关，可用于评估患者病情严重程度。本研究结果提示，EGFR、MMP-2、BRCA1、mTOR与老年直肠癌患者的预后密切相关，联合检测可用于预测患者的预后水平，为治疗方案的制定提供参考依据。

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