银屑病（psoriasis,PSO）俗称牛皮癣，是一种常见的慢性炎症性皮肤病，其特征具有白色鳞片状的红斑，分布在面部、手掌、手臂、腿部等关键区域，影响着全球6 000多万成年人和儿童，大多数银屑病患者的生活质量都受到了不同程度影响，症状严重患者更容易对心理产生影响，与普通人群相比，银屑病患者更容易出现抑郁症等心理疾病[1]。近几年，治疗银屑病的靶向药物已经产生，如甲氨蝶呤、环孢素A等，但其副作用明显，包括恶心，白细胞减少和致畸性等，并且价格较高[2]，因此需要研究出一种毒副作用低，价格低廉的治疗银屑病药物。

黄杞苷（engeletin,ENG）是一种从中药土茯苓中提取分离的二氢黄酮苷类化合物，图1是黄杞苷的分子结构式。Wu H等[3]研究发现，黄杞苷在脂多糖诱导的小鼠子宫内膜炎模型中发挥治疗作用，降低TNF-α、IL-1β、IL-6细胞因子的表达水平，并调节TLR4介导的NF-κB信号通路。Jiang X等[4]研究发现，黄杞苷显著抑制脂多糖诱导的急性肺损伤小鼠模型中TNF-α等促炎因子水平，调控NF-κB信号通路发挥抗炎作用，从而治疗急性肺损伤。Li B等[5]研究发现，黄杞苷抑制MAPK和NF-κB信号通路的激活，下调炎症因子的表达水平，在椎间盘退变大鼠模型体内注射黄杞苷，可以有效缓解症状。黄杞苷因具有抗炎作用被研究人员关注，但其治疗银屑病方面却未见报道。

网络药理学是一种从网络角度探究药物作用机理，并在生物网络的基础上寻找药物与疾病之间相互作用关系的新方法，分子对接技术可以高效准确地预测配体与受体复合物的结合活性，网络药理学和分子对接在药物研究中得到了广泛应用[6]。在研究中，利用网络药理学来挖掘黄杞苷对银屑病的治疗靶点和相关途径，为开发新的治疗银屑病的药物治疗提供理论基础。

图1黄杞苷分子结构式

1、资料与方法

1.1数据库

研究使用的数据库及网址见表1。

表1数据库名称和网址

1.2黄杞苷相关靶点获取

首先，在Pubchem中获取黄杞苷2D化学结构式和3D结构，并下载保存为SDF格式文件。利用中医药系统药理数据库和分析平台TCMSP、SwissTargetPrediction数据库、SEA数据库、PharmMapper数据库分别输入关键词Engeletin或导入黄杞苷2D化学结构式SDF格式文件，分别获取黄杞苷相关靶点基因，去除重复基因。导入Uniprot数据库，限定物种为人（Human），并且在已验证（Reviewed）的条件下进行基因官方名称的校正，得到基因名称（gene symbol），方便用于后续研究。

1.3银屑病相关靶点获取

在TTD数据库、Genecards数据库、Drugbank数据库、OMIM数据库中分别输入关键词Psoriasis检索获取相关靶点信息，将获得的靶点整理，导入Uniprot数据库，限定物种为人（Human），并且在已验证（Reviewed）的条件下进行基因官方名称的校正，矫正完毕后去除重复的靶点，所剩下的靶点视为银屑病疾病的潜在靶点，记录靶点信息备用。

1.4蛋白质互作网络构建及关键靶点的筛选

将筛选出的黄杞苷靶点和银屑病靶点输入在线韦恩图制作网站Venny 2.1中，获得黄杞苷-银屑病交集靶点。将交集靶点输入STRING数据库进行蛋白质互作网络（Protein-Protein Interaction Networks,PPI）的构建，将生物种类设定为“Homo sapiens”，得到PPI网络图，再导入Cytoscape 3.9.1软件进行可视化分析，并使用CytoHubba插件，根据插件中的MCC算法，筛选出排名前10的靶点为关键靶点。

1.5 GO和KEGG通路富集分析

将黄杞苷-银屑病交集靶点提交至Metascape平台进行GO与KEGG富集分析，设定P<0.01，结果通过微生信在线平台进行可视化分析。

1.6分子对接

根据1.3中筛选出的关键靶点，在PDB数据库中下载关键靶点的PDB格式的蛋白质三维结构，限定物种为“Homo Sapiens”，使用Autodock软件对靶点蛋白进行去除水分子、加氢处理，并保存为pdbqt格式，作为分子对接的受体。将1.1中下载的SDF格式黄杞苷3D结构文件，通过Open babel软件转换为mol2格式文件，作为分子对接的配体，使用AutoDockTools 1.5.7进行分子对接，最后使用PyMOL进行可视化分析。

2、结果与分析

2.1药物及疾病相关靶点获取

在TCMSP等4个数据库中收集黄杞苷相关靶点共356个，去除重复靶点后在Uniprot数据库中限定物种为人（Human），并且在已验证（Reviewed）的条件下矫正基因名称，剩余328个基因，确定为黄杞苷相关靶点。在TTD等4个数据库中收集银屑病相关靶点共648个，去除重复靶点后在Uniprot数据库中限定物种为人（Human），并且在已验证（Reviewed）的条件下矫正基因名称，剩余595个基因，确定为银屑病相关靶点。

2.2 PPI网络构建及关键靶点的筛选

使用Venny 2.1平台获得黄杞苷-银屑病交集靶点共66个，并制作韦恩图（图2）。使用STRING数据库建立PPI的网络，共包括66个节点，329条边。将结果导入Cytoscape 3.9.1进行可视化分析（图3），靶点的形状越大，颜色越深，说明Degree值越大，靶点在网络中越重要。使用Cytoscape 3.9.1中CytoHubba插件，利用插件中MCC算法筛选出排名前10的hub基因，并对其进行可视化处理，颜色越接近红色，说明MCC分数越高，排名前10的基因分别是ALB、MMP9、EGFR、MMP2、KDR、PTGS2、CCL5、PPARG、IL2、JAK2。

图2黄杞苷靶点与银屑病靶点韦恩图

2.3 GO和KEGG通路富集分析

应用Metascape数据平台对黄杞苷-银屑病共同靶点进行GO功能富集分析与KEGG通路富集分析。由GO富集结果可知，分别得到739项生物过程（BP）条目，主要包括对荷尔蒙的反应（response to hormone）、细胞对脂质的反应（cellular response to lipid）、炎症反应的调节（regulation of inflammatory response）等；45项细胞成分（CC）条目主要包括囊泡腔（vesicle lumen）、分泌颗粒腔（secretory granule lumen）、液泡腔（vacuolar lumen）等；76项分子功能（MF）条目主要包括羧酸结合（carboxylic acid binding）、内肽酶活性（endopeptidase activity）、丝氨酸型肽酶活性（serine-type peptidase activity）等。根据P值分别筛选排名前10的GO富集分析结果，使用微生信在线平台进行数据可视化处理（图4）。

图3黄杞苷-银屑病共同靶点PPI网络图与排名前10的hub基因

图4 GO富集分析中BP、MF和CC排名前10的条目

由KEGG富集分析结果显示，共得到80条通路，将富集程度最高的前20条通路，使用微生信在线平台进行可视化（图5）。横坐标代表GeneRatio，颜色趋于红色，说明P值越大，点的面积越大，说明富集在此条通路上的基因靶点越多。由图6可知，富集程度较高且与银屑病相关的通路包括PI3K-Akt信号通路、IL-17信号通路、TNF信号通路等。

2.4黄杞苷与关键靶点分子对接

如图6所示，a至i分别是黄杞苷与ALB、MMP9、EGFR、MMP2、KDR、CCL5、PPARG、IL2、JAK2靶点对接结果，黄杞苷与PTGS2对接过程中AutodockTools软件显示错误，因此无法对接。表2为对接蛋白质靶点在PDB数据中的ID及与黄杞苷对接的结合能。通常认为当结合能小于0时，小分子配体与靶点具有良好的结合活性，当结合能小于-5 kcal·mol-1时，说明小分子配体与靶点具有较强的结合能力[7]。根据分子对接结果，黄杞苷与除PTGS2外的关键靶点的结合能均小于0，说明与关键蛋白都具有较好的结合能力。

图5 KEGG通路富集分析气泡图

图6分子对接结果可视化

表2黄杞苷与关键靶点分子对接结果

3、讨论

20世纪80年代初，银屑病就已经被确定为由T细胞介导的慢性炎症复发性皮肤疾病，许多免疫细胞和非免疫细胞也对疾病的发病起到了影响，如树突细胞，中性粒细胞，角质形成细胞等，但T细胞的重要性已经被证实。参与银屑病发病机制的细胞，通过分泌TNF-α、IFN-γ、IL-17等细胞因子及角质形成细胞不可控制的增殖分化，促使表皮过度生长，中性粒细胞浸润及增加Th1/Th17细胞数量，从而加长炎症持续的时间，导致银屑病反复发作，难以治愈[8-9]。在治疗药物选择方面，如果受银屑病影响的皮肤面积较小，小于体表面积的3%～5%，一般情况下选择外用涂抹型药物，主要包括皮质类固醇、维生素D3类似物等。光疗也是银屑病治疗方法之一，紫外线辐射由局部的免疫抑制作用，对郎格罕细胞产生影响，抑制表皮过度增殖和血管生成，并会导致T细胞的凋亡。光疗副作用明显，存在致癌的潜在风险并且耗费时间，目前使用光疗治疗的患者较少。生物靶向药物的出现极大地帮助了银屑病患者，如抗TNF-α药物阿达木单抗（adalimumab）、抗IL-17药物依奇珠单抗（ixekizumab）、优特克单抗（ustekinumab）等。靶向药物高度特异性靶向炎症介质，减轻炎症反应，从而发挥治疗作用。虽然生物制剂治疗效果良好，明显改善患者生活质量，但是价格较高，治疗周期长，对患者家庭经济负担过大，可能产生鼻咽炎、血脂升高及感染等副作用[10]。相比于传统的治疗药物，中医药有着价格低廉，毒副作用小，并且从多靶点、多途径来治疗疾病的优势。研究利用网络药理学与分子对接探究黄杞苷治疗银屑病的潜在作用机制，为黄杞苷的临床应用提供理论基础。

研究通过使用网络药理学方法，获得黄杞苷靶点328个，银屑病靶点595个，黄杞苷-银屑病交集靶点66个，利用STRING数据库构建PPI网络，并用Cytoscape进行可视化处理，通过CytoHubba插件筛选出在PPI网络中的排名前10的关键靶点。其中，表皮生长因子受体（EGFR）是一种受体酪氨酸激酶，已被证明可以调控皮肤炎症反应，包括银屑病在内的多种皮肤病与EGFR信号的异常激活有关，抑制EGFR的表达与激活，有可能是治疗银屑病的有效手段[11]。KDR也被称作VRGFR2，是血管内皮细胞生长因子（vascular endothelial growth factor,VEGF）的受体之一。血管生成是银屑病等慢性炎症性疾病发病机制的重要标志，有研究表明KDR是参与内皮细胞存活、增殖和血管通透性的主要受体，KDR表达水平被抑制可能是介导其抗血管生成作用的关键机制[12]。Glazewska E K等[13]研究发现，MMP-2的表达水平随疾病加重而升高，并在治疗后MMP-2表达水平逐渐下降。Chen J等[14]研究发现，抑制中性粒细胞分泌MMP-9的表达可有效减少银屑病相关的表皮增生和炎症。Buommino E等[15]研究表明，银屑病患者体内MMP-9表达水平高于与普通人群，经过抗TNF-α药物治疗后，MMP9表达水平显著降低。分析PPI网络发现，EGFR、KDR、MMP-2和MMP-9均属于关键蛋白，分子对接结果显示，黄杞苷与KDR结合能为-5.61，小于-5 kcal·mol-1，黄杞苷与KDR结合活性最高，与4个氨基酸残基形成氢键相互作用，分别是GLU-1003、THR-1001、LYS-939、ALA-941。与EGFR结合能为-4.23，小于0，结合活性较好，与1个氨基酸残基形成氢键相互作用，氨基酸残基为ASN-449。与MMP-2结合能为-3.95 kcal·mol-1，与5个氨基酸残基形成氢键相互作用，分别是ASP-45、ARG-150、PHE-149、ARG-38、LYS-147。与MMP-9结合能为-4.29 kcal·mol-1，与3个氨基酸残基形成氢键相互作用，分别是ARG-95、GLY-186、ARG-51。通过分析PPI网络与分子对接结果，提示上述4个靶点可能与黄杞苷治疗银屑病潜在机制密切相关。

KEGG富集分析结果显示，与银屑病相关的通路主要涉及PI3K/Akt信号通路、IL-17信号通路、TNF细胞分化、Th17信号通路。PI3K/Akt信号通路与表皮屏障功能、毛囊再生、皮肤伤口愈合和皮肤衰老密切相关，PI3K/Akt信号通路异常活化会导致一系列的恶性或非恶性皮肤疾病，包括恶性黑色素瘤、痤疮、银屑病、特应性皮炎等疾病。PI3K/Akt信号通路在银屑病发展过程中发挥重要作用，该信号通路正向调控Th17细胞的分化，参与调控表皮稳态。有研究表明，与正常和非病变皮肤相比，银屑病病变角质形成细胞中p-AKT蛋白水平以及PI3K和AKT的表达显著升高[16-18]。Th17导致了许多自身免疫性和炎症性疾病的发病。在银屑病中，Th17细胞是最关键的致病因素。它分泌的细胞因子，如IL-17A、IL-17F等在疾病的发生和发展中发挥着重要作用[19]。在银屑病患者皮损中IL-17含量明显高于普通人群，并且与银屑病皮损面积和严重程度指数（psoriasis activity and severity index,PASI）评分呈明显正相关，IL-17在银屑病发病机制中占据关键地位[20]。TNF是一种功能复杂的细胞因子，可诱导表皮角质形成细胞增殖并释放炎症因子，在银屑病患者的血清和皮损中均表达异常，通过靶向TNF-α治疗银屑病十分有效。大量研究表明，TNF-α抑制剂是对使用传统方法治疗银屑病效果差，且患有重度银屑病患者的另一个选择[21-24]。KEGG通路富集分析结果提示，黄杞苷可能通过调控PI3K/Akt信号通路异常活化，抑制促炎细胞因子的分泌，通过多个靶点与信号通路发挥对皮肤组织的保护作用及对银屑病的治疗作用。

网络药理学的提出对靶向药物的研发、疾病的靶向治疗，帮助巨大。网络药理学存在不足，如药物和疾病的靶点需要通过数据库来收集，数据库的准确性，完整性需要进一步完善。一些数据库中包含的药物靶点信息有限，很难全面的对其进行分析，并且更新数据速度较慢。虽然网络药理学的发展还处于初级阶段，但是已经为中药相关研究提供新的策略。随着科技的发展，数据库不断完善，试验方法和技术的不断创新，网络药理学在中医药的领域中会有更大的贡献。

4、结论

综上所述，银屑病是一种由免疫系统介导，多种免疫细胞和细胞因子相互作用所导致的慢性炎症性皮肤疾病。基于网络药理学方法和分子对接，阐明了黄杞苷治疗银屑病可能通过作用于MMP2、MMP9、EGFR、KDR等多个靶点，调控PI3K/Akt、IL-17等多条信号通路发挥治疗作用，为黄杞苷治疗银屑病的临床应用提供了一定的理论依据。

参考文献:

[6]马杰.基于网络药理学探讨清热凉血方活性成分经PI3K/AKT/GLUT1通路干预银屑病的作用[D].北京:北京中医药大学,2020.

[9]宋博翠,蒋萌萌,韩宇,等.大黄酚对环磷酰胺诱导的免疫抑制小鼠的免疫保护作用[J].黑龙江八一农垦大学学报,2019,31(6):66-71.

基金资助:黑龙江省博士后科研基金启动项目(LBH-Q21158);

文章来源:李宇琦,王璇,陈倩,等.基于网络药理学及分子对接探究黄杞苷治疗银屑病的潜在靶点和机制预测[J].黑龙江八一农垦大学学报,2024,36(05):104-111