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响应面法优化涡旋辅助提取胆木中异长春花苷内酰胺的工艺

2024-09-21 34 上传者：管理员

摘要：目的采用响应面法优化胆木中异长春花苷内酰胺的涡旋辅助提取工艺。方法在单因素试验的基础上通过Box-Behnken方法对乙醇浓度、涡旋转速、液料比等参数进行优化，建立参数与响应值之间的数学模型，确定最佳提取工艺。结果生物碱的最佳工艺为：乙醇浓度55%，涡旋转速1500 r·min-1，液料比60 mL/g，涡旋时间1 min，该条件下异长春花苷内酰胺的实际提取率为3.85 mg·g-1，与理论模拟值(3.82 mg·g-1)接近。结论该提取方法简便、快速、提取率高，适用于胆木生物碱的提取，研究结果为胆木的产业化加工提供了理论基础。

关键词：
响应面分析
异长春花苷内酰胺
提取工艺
涡旋
胆木
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胆木Nauclea officinalis为茜草科(Rubiaceae)乌檀属NaucleaL.乔木，又名乌檀、黄杨木、山熊胆，是海南省特色黎药，也是我国重点保护的珍稀野生植物物种之一[1-3]。胆木具有抗炎作用，用于治疗感冒、发烧、咽喉肿痛、红眼病等病症[3-4]。现代化学和药理学研究表明，胆木含有生物碱、酚酸等化合物，其中生物碱是其抗炎活性的主要成分[1，5-6]。

吲哚类生物碱是胆木中生物碱的主要类型，异长春花苷内酰胺是其主要有效成分，具有抗菌、抗病毒、抗炎、镇痛、止咳平喘、抗肿瘤、杀疟原虫等多种药理作用[7-10]。目前，超声提取和加热回流提取是异长春花苷内酰胺的主要提取方法[1，3-4]，但这些提取方法存在提取时间长、耗能多等缺点。涡旋振荡提取法是在提取过程中外加涡旋作用力，增大提取溶剂与样品之间的接触面积，加快目标物质的传质速度，具有试剂消耗少、耗时短、操作简便的优点[11]。该方法已在五味子中木脂素类化合物[12]、枇杷中萜类化合物[13]等活性成分的提取中应用。与传统提取方法相比，涡旋辅助提取具有缩短了提取时间、溶剂用量少、提取效率高等优点。但该方法在胆木生物碱的提取中还未见报道。

本研究以异长春花苷内酰胺为考察指标，采用响应面法(Box-Behnken)优化涡旋辅助振荡提取胆木生物碱工艺，研究结果在胆木生物碱的快速高效提取上具有较大的应用前景，为胆木资源的开发利用，质量控制提供参考。

1、材料

1.1试药

胆木样品收集于海南省琼中县，甲醇、乙腈(德国默克公司，色谱纯)，磷酸(上海麦克林生化科技有限公司，色谱纯)，无水乙醇(西陇科学股份有限公司，分析纯)，纯净水(杭州娃哈哈集团有限公司)，异长春花苷内酰胺对照品(纯度≥98%，批号：nkl220209001，成都钠钶锂生物科技有限公司)。

1.2仪器

1290型全二维超高效液相色谱仪(美国安捷伦公司)，检测器1290 DAD(安捷伦G7117B)，色谱柱ACQUITY BEH C18column(100 mm×2.1 mm，1.7μm；美国沃特世公司)，涡旋混合器(澳大利亚瑞德科仪器有限公司)，BSA224S-CW万分之一电子天平(上海托利多有限公司)。

2、方法与结果

2.1胆木样品的制备

称取胆木粉末0.5 g，放置于50 mL离心管中，加入55%乙醇30 mL，涡旋(1500 r·min-1)1 min，离心，取适量上清液过0.22μm微孔滤膜，备用。

2.2对照品溶液的制备

精密称取一定质量的异长春花苷内酰胺对照品，用甲醇溶解配制成质量浓度为1000μg·mL-1的对照品储备液，4℃保存，备用。不同质量浓度(0.07～300μg·mL-1)的对照品溶液由储备液稀释得到。

2.3色谱条件

以0.4%磷酸-水(A)和乙腈(B)为流动相，梯度洗脱：0～5 min，8%～22%B；5～11 min，22%～48%B；11～12 min，48%～8%B；流速：0.2 mL·min-1；进样量：1μL；柱温：35℃；检测波长：226 nm。

2.4方法学考察

根据《中国药典》，分别从精密度、重现性、稳定性以及加样回收率对方法学进行了考察。其中，其中精密度、重现性和稳定性的RSD<1%，平均加样回收率>98%，线性相关系数r=1.000。在“2.3”项的色谱条件下，异长春花苷内酰胺对照品及胆木样品的专属性色谱图见图1，胆木样品与对照品在相同时间点出现同一色谱峰，空白溶剂无干扰，专属性符合要求。

图1空白溶剂(A)、对照品(B)及样品(C)的UPLC色谱图

2.5单因素优化胆木涡旋提取工艺

分别对不同浓度的乙醇(20%～100%)、涡旋转速(500～2500 r·min-1)、涡旋时间(1～15 min)、液料比(10～90 mL/g)进行单因素优化，考察对异长春花苷内酰胺提取率的影响，结果见图2。由图2可知，异长春花苷内酰胺的含量随着乙醇浓度的增加，先升高后降低(见图2A)，当乙醇浓度为60%时，含量最高；乙醇浓度大于60%时，异长春花苷内酰胺的含量有所下降，可能是随着乙醇浓度的提高，细胞中蛋白质发生变性[14]，不利于异长春花苷内酰胺的溶出。涡旋时间对异长春花苷内酰胺的提取效果影响不大(见图2B)。当涡旋转速增加时，异长春花苷内酰胺的含量逐渐增加。当涡旋转速从1500 r·min-1增加到2500 r·min-1时，异长春花苷内酰胺的含量无显著增加(见图2C)。当液料比从10 mL/g升高到50 mL/g时，异长春花苷内酰胺的提取率逐渐增加。当液料比从50 mL/g进一步增大到90 mL/g时，异长春花苷内酰胺的含量变化不明显(见图2D)。

图2不同提取参数对异长春花苷内酰胺含量的影响

2.6响应面法优化胆木涡旋提取工艺

在单因素试验结果的基础上，选取乙醇浓度、涡旋转速、液料比为主要考察因素，以异长春花苷内酰胺提取率为响应值，根据Box-Behnken中心组合试验设计3因素3水平，具体参数见表1。

表1胆木涡旋提取工艺响应面设计因素水平表

表2胆木涡旋提取工艺响应面设计与结果

为了检验模型的有效性，对所建立的数学模型及其回归系数进行方差分析，结果见表3。从表3可知，该回归模型达到了极显著水平(P<0.0001)，且失拟项不显著(P>0.05)，拟合程度良好(R2=0.9940)。同时，该拟合方程较好地反映了乙醇浓度、涡旋转速以及液料比与胆木中异长春花苷内酰胺含量的关系(AdjR2=0.9864)。此外，一次项中X1，X2，X3和二次项中X12，X22，X32对胆木中异长春花苷内酰胺提取的影响达到极显著水平，交互项中X2X3达到显著水平。综上，该模型可以用于涡旋振荡法提取胆木中异长春花苷内酰胺的分析与预测。

表3回归模型方差分析

图3直观地反映了各试验因素的交互作用对胆木生物碱提取率的影响。乙醇浓度、涡旋转速和液料比两两因素之间存在明显的交互作用。涡旋转速和液料比交互作用对异长春花苷内酰胺提取率的影响较为显著，这与方差分析所得结论一致。由图3A可知，乙醇浓度和转速交互时，乙醇浓度影响响应面变化程度较高。涡旋转速和液料比的曲线陡峭程度相近，说明涡旋转速和液料比交互时，两个因素影响响应面变化程度相差不大(见图3B)。乙醇浓度的曲线比液料比的曲线更陡峭，表明乙醇浓度和液料比交互时，乙醇浓度影响响应面变化程度较为敏感(见图3C)。

2.7最佳提取工艺的确定与验证

基于上述模型预测胆木中异长春花苷内酰胺的最佳提取条件为：乙醇浓度52%、涡旋转速1500 r·min-1、液料比59 mL/g，异长春花苷内酰胺的理论含量为3.82 mg·g-1。为了检查预测响应值的可靠性，在优化条件下进行了3次验证测试。考虑操作方便性，选择乙醇浓度55%、涡旋转速1500 r·min-1、液料比60 mL/g作为最佳提取条件。在该条件下，异长春花苷内酰胺的实际含量为3.85 mg·g-1，与预测值接近，偏差率为0.79%。由此可见，所建立的模型可靠、准确。

2.8涡旋提取胆木生物碱与传统提取方法的比较

分别采用超声和加热回流两种方法进行提取，并与涡旋振荡辅助提取方法进行比较，结果见表4。涡旋、超声和加热回流3种提取方法测得异长春花苷内酰胺的含量分别为3.85、3.88和2.65 mg·g-1。涡旋辅助提取1 min得到的异长春花苷内酰胺含量与传统超声提取30 min的含量相当，加热回流提取法的含量最低。

图3涡旋辅助提取对异长春花苷内酰胺含量影响的响应面图和等高线图

表4涡旋提取法与传统提取方法的比较

3、讨论

胆木是中国传统中药材，也是海南省深入研究传统黎药药效物质基础的重点药材之一。目前市场上以黎药胆木为原料的药品主要有胆木注射液、胆木浸膏糖浆、胆木浸膏片等。异长春花苷内酰胺是胆木药材和胆木中药制剂的主要有效成分，也是评价胆木注射液和胆木浸膏糖浆的指标成分[3，15-16]。目前，常见的异长春花苷内酰胺的提取方法主要有加热回流提取和超声提取法[2，4]，这两种方法存在溶剂消耗大、操作复杂、耗时、耗能等缺点。因此，本研究以异长春花苷内酰胺为考核指标，采用涡旋辅助提取方法，通过Box-Behnken响应面法对其提取工艺进行优化。在响应面优化中，考虑了试验的随机误差，有助于提高优化结果的可靠性和准确性。

本研究首先考察了乙醇浓度、涡旋转速、涡旋时间、液料比4个单因素对异长春花苷内酰胺提取效率的影响，研究表明除涡旋时间外其他3个因素均对提取率有一定的影响。在单因素试验的基础上，利用Box-Behnken方法对乙醇浓度、涡旋转速、液料比3个参数进行优化，建立了预测模型，确定了最佳提取工艺为乙醇浓度55%，涡旋转速1500 r·min-1，液料比60 mL/g，涡旋时间1 min。并通过验证试验证明了该模型的可靠性，结果表明理论值和实测值误差较小，能很好地预测与分析异长春花苷内酰胺的提取工艺。最后，将涡旋提取与超声提取和加热回流提取两种传统提取方法进行了比较分析，结果表明涡旋辅助提取方法具有简便、快速、高效等特点，克服了传统提取方法耗时长、提取率低、操作复杂的缺点。本研究为胆木生物碱的提取提供了新的方法，也为胆木的产业化应用提供了参考。

参考文献:

[1]王静静,蒋俊,朱粉霞,等.HPLC法同时测定胆木及其制剂中酚酸和生物碱类成分[J].中成药,2012,34(12):2326-2330.

[2]张钰昕,周明艳,谢振蕊,等.不同生长年限和同一年度不同月份胆木化学成分含量研究[J].海南医学院学报,2021,27(12):936-942.

[3]侯倩煜,李飞宇,陈燕艳,等.UPLC-PDA测定胆木中异长春花苷内酰胺含量[J].中南药学,2022,20(4):915-918.

[7]马雅銮,胡镜清.胆木的研究进展[J].中华中医药杂志,2017,32(7):3079-3082.

[8]李娜,曹亮,丁岗,等.异长春花苷内酰胺抗菌､抗病毒作用研究[J].中国实验方剂学杂志,2012,18(15):170-174.

基金资助:海南省自然科学基金青年基金项目(No.821QN0948); 中国医学科学院医学与健康科技创新工程创新项目(No.2021-I2M-1-032);

文章来源:樊小红,吕菲菲,赵祥升,等.响应面法优化涡旋辅助提取胆木中异长春花苷内酰胺的工艺[J].中南药学,2024,22(09):2350-2354.