柴胡(Bupleurum chinensis DC.)，一种源远流长的传统中药材，自《神农本草经》以来已被广泛应用于透表泄热、疏肝解郁、升举阳气等治疗作用，且其有效性得到了两千多年的实践验证。现代植物化学研究揭示，柴胡中含有丰富的精油、三萜皂苷、聚乙炔、黄酮类等生物活性成分，具有显著的抗炎、抗菌、抗病毒、抗癌及免疫调节等药理作用(Yang et al.,2017)。其中，柴胡皂苷A (Saikosaponin A,SSA)作为一种主要的三萜皂苷，已被证实具有通过ERK/NF-κB信号通路减轻炎症的能力(Kim et al.,2015)，并能通过PI3K/AKT/Nrf2途径抑制氧化应激及减轻慢性疾病引起的组织萎缩(Huang et al.,2023)。

肥胖已成为全球关注的重大健康问题，它不仅关联着多种代谢紊乱，如Ⅱ型糖尿病、心血管疾病，还与某些类型的癌症有密切关系(Seravalle and Grassi,2017;Perdomo et al.,2023)。目前，用于治疗肥胖的药物主要分为两大类：一类是通过调节中枢神经系统来控制食物摄入的食欲抑制剂，如西布曲明和利莫那班，这些药物常伴随着如增加血压、心律失常等副作用(Luque and Rey,1999;Leite et al.,2009)；另一类则是抑制食物中特定营养素的吸收，如奥利司他，但这可能导致脂肪泻及营养缺失(Heck et al.,2000)。鉴于现有治疗手段的局限性，科研界正寻求不影响中枢神经系统而直接调节能量代谢的新型治疗策略。

最新的研究表明，柴胡皂苷A在肥胖管理中表现出潜在的应用价值。Lim等(2021)的研究发现，柴胡皂苷A和D能显著抑制3T3-L1脂肪细胞中的脂质积聚，并剂量依赖性地抑制脂肪生成相关基因的表达，同时增强能量代谢调控基因AMPK的磷酸化，从而展示了其抗肥胖的药理活性。因此，本研究将探讨柴胡皂苷A联合有氧运动在肥胖大鼠模型中的综合治疗效果，旨在为抗肥胖药物的研发提供新的候选方案。

1、结果与分析

1.1 柴胡皂苷A联合有氧运动对肥胖大鼠体重的影响

实验开始前，与正常对照组(NC组)相比，所有实验组的体重均有显著增加(P<0.05)。实验结束时，与NC组相比，模型对照组(M组)的体重依然显著增高(P<0.05)(表1)。然而，与M组相比，单独有氧运动组(AE组)、低剂量柴胡皂苷A组(L-SSA组)、中剂量柴胡皂苷A组(M-SSA组)、高剂量柴胡皂苷A组(H-SSA组)以及有氧运动联合高剂量柴胡皂苷A组(AE+H-SSA组)的体重均显著减少(P<0.05)。与单独的AE组和H-SSA组相比，AE+H-SSA组的体重降低更为显著(P<0.05)。

研究结果表明，柴胡皂苷A与有氧运动的联合应用对于减轻肥胖大鼠的体重具有显著效果，表明其作为潜在抗肥胖治疗方案的有效性。

1.2 柴胡皂苷A联合有氧运动对肥胖大鼠血清脂代谢指标的影响

实验结果显示(图1)，与正常对照组(NC组)相比，模型组(M组)的血清总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-c)水平显著升高，而高密度脂蛋白胆固醇(HDL-c)水平则显著降低(P<0.05)。在与模型组比较后发现，有氧运动组(AE组)、低剂量柴胡皂苷A组(L-SSA组)、中剂量柴胡皂苷A组(M-SSA组)、高剂量柴胡皂苷A组(H-SSA组)以及有氧运动结合高剂量柴胡皂苷A组(AE+H-SSA组)的血清TC、TG、LDL-c及FFA水平均有显著下降，HDL-c水平则有显著上升(P<0.05)。在有氧运动组和高剂量柴胡皂苷A组相比，联合治疗组(AE+H-SSA组)的血清TC、TG、LDL-c和FFA水平进一步显著下降，而HDL-c水平显著增加(P<0.05)(图1)。这些结果表明，柴胡皂苷A与有氧运动的联合应用有效改善了肥胖大鼠的血脂代谢状况。

表1 大鼠体重数据及整体差异比较

1.3 柴胡皂苷A联合有氧运动对肥胖大鼠肝脏脂质积累的影响

通过HE染色观察，正常对照组(NC组)的肝脏形态显示正常结构，而模型组(M组)的肝脏出现了明显的脂肪变性，肝细胞内可见典型的脂滴积累。与模型组相比，单独进行有氧运动的组(AE组)、低剂量柴胡皂苷A治疗组(L-SSA组)、中剂量柴胡皂苷A治疗组(M-SSA组)、高剂量柴胡皂苷A治疗组(H-SSA组)以及联合有氧运动和高剂量柴胡皂苷A治疗的组(AE+H-SSA组)中，肝脏的脂质积累均有明显减少，特别是在AE+H-SSA组中，肝脏的脂质积累几乎未见(图2)。这些结果表明，柴胡皂苷A联合有氧运动有效减少了肥胖大鼠的肝脏脂质积累，显示出潜在的治疗效果。

1.4 柴胡皂苷A联合有氧运动对肥胖大鼠肝脏抗氧化系统的影响

与正常对照组(NC组)相比，模型组(M组)的肝脏中超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)和过氧化氢酶(CAT)的活性显著下降，而丙二醛(MDA)水平显著上升(P<0.05)，反映出显著的氧化应激增加。

相较于M组，单独有氧运动组(AE组)、低剂量柴胡皂苷A组(L-SSA组)、中剂量柴胡皂苷A组(M-SSA组)、高剂量柴胡皂苷A组(H-SSA组)以及有氧运动结合高剂量柴胡皂苷A组(AE+H-SSA组)的肝脏SOD、GSH-Px和CAT水平均显著提高，MDA水平显著下降(P<0.05)。这表明柴胡皂苷A和有氧运动均能有效改善肝脏的抗氧化能力。

图1 大鼠血清脂代谢指标水平变化

图2 大鼠肝脏HE染色图像(100×)

进一步分析发现，与单独的AE组和H-SSA组相比，AE+H-SSA组在提升SOD、GSH-Px和CAT水平以及降低MDA水平方面表现更为显著(P<0.05)(图3)。这一结果强调了柴胡皂苷A与有氧运动联合应用在增强肥胖大鼠肝脏抗氧化防御系统方面的协同效应。

1.5 柴胡皂苷A联合有氧运动对肥胖大鼠肝脏炎症的影响

在实验中，与正常对照组(NC组)相比，模型组(M组)的大鼠肝脏中炎症因子TNF-α、IL-1β和IL-6的水平显著升高(P<0.05)。当介入有氧运动(AE组)、低剂量柴胡皂苷A (L-SSA组)、中剂量柴胡皂苷A(M-SSA组)、高剂量柴胡皂苷A (H-SSA组)以及有氧运动联合高剂量柴胡皂苷A (AE+H-SSA组)后，与M组相比，这些炎症因子的水平均有显著下降(P<0.05)。当有氧运动与高剂量柴胡皂苷A联合应用(AE+H-SSA组)时，其效果优于单独的有氧运动组或高剂量柴胡皂苷A组，肝脏中TNF-α、IL-1β和IL-6的水平进一步显著降低(P<0.05)(图4)。这些结果表明，柴胡皂苷A联合有氧运动有效减轻了肥胖大鼠的肝脏炎症。

1.6 柴胡皂苷A联合有氧运动对肥胖大鼠肝脏脂代谢基因转录的影响

与正常对照组(NC组)相比，模型组(M组)的肝脏中CCAAT/增强子结合蛋白α (C/EBPα)、类固醇调节元件结合蛋白1c (SREBP1c)、脂联素(Adiponectin)、脂肪酸结合蛋白4 (FABP4)、脂肪酸合酶(FAS)和脂蛋白脂酶(LPL)的m RNA表达水平显著上升(P<0.05)。然而，在接受了柴胡皂苷A和/或有氧运动治疗的实验组[AE组,低剂量柴胡皂苷A组(L-SSA组),中剂量柴胡皂苷A组(M-SSA组),高剂量柴胡皂苷A组(H-SSA组)及AE+H-SSA组]中，这些基因的表达水平均显著下降(P<0.05)。在柴胡皂苷A高剂量联合有氧运动的组合治疗组(AE+H-SSA组)中，与单独柴胡皂苷A高剂量组(H-SSA组)或单独有氧运动组(AE组)相比，肝脏中上述基因的表达进一步显著减少(P<0.05)(图5)。

上述结果表明，柴胡皂苷A结合有氧运动能有效纠正由肥胖引起的肝脏脂代谢基因转录异常，可能通过调节这些关键基因的表达促进脂质代谢和能量平衡。

图3 大鼠肝脏氧化应激因子水平变化

1.7 柴胡皂苷A联合有氧运动对肥胖大鼠肝脏Nrf2和NF-κB通路的影响

相较于正常对照组(NC组)，模型组(M组)的大鼠肝脏细胞核内Nrf2蛋白的相对水平显著降低，而NF-κB的磷酸化水平则显著升高(P<0.05)。与模型组相比，单独进行有氧运动的组(AE组)、低剂量柴胡皂苷A处理组(L-SSA组)、中剂量柴胡皂苷A处理组(M-SSA组)、高剂量柴胡皂苷A处理组(H-SSA组)以及联合高剂量柴胡皂苷A与有氧运动的组(AE+H-SSA组)显示出肝脏细胞核内Nrf2蛋白水平的显著上升和NF-κB p65磷酸化水平的显著下降(P<0.05)。进一步比较发现，AE+H-SSA组相比于单独的AE组和H-SSA组，Nrf2蛋白的相对水平进一步上升，而NF-κB p65的磷酸化水平进一步下降(P<0.05)(图6)。这些结果表明，柴胡皂苷A结合有氧运动能有效激活肝脏的Nrf2通路，并抑制NF-κB通路，从而可能对抗肥胖相关的肝脏氧化应激和炎症反应。

图4 大鼠肝脏抗炎症因子水平变化

图5 大鼠肝脏脂代谢基因mRNA相对水平变化

2、材料与方法

2.1 柴胡皂苷A的提取及鉴定

(1)原材料准备：选择新鲜的柴胡(Bupleurum chinensis DC.)植物，收集其根和茎部分。确保材料来源的一致性和新鲜度，以保证提取物的质量。

(2)干燥和粉碎：将收集的柴胡清洗干净，去除杂质和非目标部分，然后在阴凉通风的地方或使用食品级热风干燥机干燥至恒重。干燥后的柴胡使用粉碎机粉碎成细粉，以增加提取效率。

(3)提取过程：将粉碎后的柴胡粉末按照1:10的比例(w/v)加入70%的乙醇溶液，使用超声波提取法在室温下提取3次，每次40 min。结合所有提取液，并通过真空旋转蒸发器在45℃下除去乙醇，获得浓缩的提取物。

(4)分离和纯化：将浓缩的提取物进行初步分离，使用硅胶柱色谱法，选择合适的有机溶剂(如氯仿和甲醇)作为洗脱剂进行梯度洗脱。收集含有柴胡皂苷A的洗脱部分，进一步使用高效液相色谱(HPLC)进行纯化。选择合适的C18柱和移动相(如乙腈-水梯度)，调整流速和检测波长以优化分离条件。

(5)鉴定和定量：使用高效液相色谱-质谱联用(HPLC-MS)技术对纯化后的样品进行结构鉴定和纯度分析。通过对比已知的柴胡皂苷A的质谱图和保留时间，确认样品中的主要成分。使用外标法定量，确保柴胡皂苷A的纯度达到98.53%。

(6)纯度验证：对纯化后的柴胡皂苷A进行再次HPLC分析，确认其峰纯度。若必要，进行进一步的重结晶或再次纯化以达到所需的纯度标准。将纯化并验证后的柴胡皂苷A存放在干燥、避光的环境中，以保持其稳定性和生物活性。

2.2 实验动物来源、饲养及建模

七周龄雄性SPF级SD大鼠(体质量250～300 g)由兰州大学实验动物中心提供，具体许可证编号为SCXK(甘)2023-0003。所有大鼠均在23℃～25℃、50%～70%相对湿度的屏障环境中进行饲养，确保实验环境的稳定性。

为建立肥胖模型，大鼠自饲养开始便采用高脂饲料喂养，持续16周。通过对比体重，将体重超过以常规饲料喂养大鼠20%的个体选为肥胖模型。此方法确保了所选大鼠具有明显的肥胖特征，适合后续的实验研究。

2.3 动物分组及处理

实验大鼠共分为7组，每组12只：正常对照组(NC组)、模型组(M组)、有氧运动组(AE组)、低剂量柴胡皂苷A组(L-SSA组)、中剂量柴胡皂苷A组(M-SSA组)、高剂量柴胡皂苷A组(H-SSA组)及有氧运动结合高剂量柴胡皂苷A组(AE+H-SSA组)。

NC组：给予正常饲料，作为健康对照。

其他组：均设为肥胖模型大鼠。除NC组外，所有组均接受高脂饮食。

NC组与M组：不进行运动训练，每日灌胃0.5%羧甲基纤维素钠(CMC-Na)。

AE组：执行有氧运动训练，同时灌胃0.5%CMC-Na。

L-SSA组、M-SSA组、H-SSA组：不进行运动，分别灌胃5 mg/kg、10 mg/kg、20 mg/kg柴胡皂苷A。

AE+H-SSA组：进行有氧运动训练，同时灌胃20 mg/kg柴胡皂苷A。

有氧运动方案：使用安徽正华ZH-PT/5S动物实验跑台。

第一周为适应期，速度逐日从5 m/min逐渐增至15 m/min，时间从30 min逐步延长至60 min。

从第二周开始，固定速度为15 m/min，持续时间60 min，每周进行5 d，连续6周。

柴胡皂苷A的给药时间：在运动开始前2 h给予，持续给药6周。

2.4 血清脂质代谢指标检测

实验前，大鼠经过整夜禁食。在第二天早晨，通过腹主动脉采血，并使用EDTA作为抗凝剂。采血后，血液样本静置2 h后，在4℃的环境下以3 000 r/min的速度离心15 min，以获取血清。血清中的总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-c)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-c)及游离脂肪酸(FFA)等脂质代谢指标，使用贝克曼库尔特AU480全自动生化分析仪进行测定。

2.5 肝脏组织学观察

采血后立即取出大鼠全肝组织，并用4%的多聚甲醛溶液在4℃条件下进行固定。固定好的肝组织进行脱水处理后，采用石蜡包埋技术，然后切制成4μm厚的组织切片。使用苏木精-伊红(HE)染色法对肝组织切片进行染色，以观察组织结构的变化。

2.6 肝脏氧化应激与炎症因子检测

将肝组织在低温条件下细致剪碎后，使用均质器将其研磨成均匀的组织浆。将组织浆在4℃下以12 000 r/min的速度离心15 min，收集上清液。根据试剂盒的说明书，测定肝脏中的氧化应激相关指标，包括超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、过氧化氢酶(CAT)和丙二醛(MDA)。同时检测炎症相关因子，包括肿瘤坏死因子α (TNF-α)、白细胞介素1β (IL-1β)和白细胞介素6 (IL-6)。

2.7 RT-q PCR分析

RNA提取和纯度检测：使用Trizol试剂从肝脏组织中提取总RNA。利用超显微分光光度计测量A260/A280比值，以评估RNA的纯度和浓度，确保其适用于后续实验。

c DNA合成：采用ABScript III RT Master Mix for q PCR with g DNA Remover按照厂商提供的协议进行反转录，将提取的RNA转化为c DNA。此步骤包括去除基因组DNA，以避免PCR中的潜在干扰。

实时定量PCR (RT-q PCR)：使用ABI 7500 PCR系统进行RT-q PCR分析。实验中加入特定的引物和2×Universal SYBR Green Fast q PCR Mix进行扩增。PCR的具体条件设置如下：初始变性阶段，95℃持续5 min；之后是40个循环，每个循环包括95℃10 s、60℃20 s和72℃20 s。所有引物的序列已列出(表2)。

数据分析：以β-actin基因作为内参基因，采用2-△△Ct方法计算目标基因的相对表达量，以评估其在不同样本中的表达差异。

2.8 Western blot分析

从-80℃冰箱中取出所需的肝组织样本，并准确称重20 mg。将样本置入含有RIPA裂解缓冲液和蛋白酶及磷酸酶抑制剂的200μL预制蛋白提取液中。使用研磨机在4℃条件下将组织研磨至完全破碎。随后，在4℃条件下以12 000 r/min的速度离心10 min，并取上清液进行后续分析。

使用BCA法测定上清中的蛋白浓度。根据测得的蛋白质浓度，调整每个样品以便加载60μg蛋白至10%SDS-PAGE凝胶中进行电泳分离。之后，将分离的蛋白电转移到PVDF膜上。

将PVDF膜在5%脱脂牛奶溶液中室温封闭1 h，以阻挡非特异性结合。封闭后，将膜与针对Nrf2、Lamin B1 (作为核蛋白内参)、p-NF-κB p65、NF-κB p65以及β-actin (作为总蛋白内参)的一级抗体在4℃条件下孵育过夜。第二天，使用相应的二级抗体在室温下孵育1 h。

通过ECL方法进行显影后，使用Image J软件对蛋白条带进行定量分析。最后，对目标蛋白的相对表达量进行统计分析，以评估其在不同样本中的变化情况。

表2 引物序列

2.9 统计学处理

实验数据通过IBM SPSS Statistics 21软件进行统计分析。对于符合正态分布的计量数据，采用单因素方差分析进行处理。组间两两比较时使用LSD(最小显著差)检验。所有统计测试的显著性水平设定为P<0.05。

3、讨论

柴胡(Bupleurum chinensis DC.)作为一种传统中药，已广泛应用于临床治疗多种疾病。虽然柴胡在治疗肥胖领域的研究尚不充分，但其主要活性成分三萜皂苷显示出多方面的生物学和药理作用，如免疫调节、抗炎、抗肿瘤和保肝等(Huang et al.,2009;Tian et al.,2009)。目前，已从柴胡中分离出多种三萜皂苷，其中柴胡皂苷A (SSA)是其重要的生物活性成分(Sui et al.,2021)。本研究进一步探讨了柴胡皂苷A联合有氧运动对肥胖大鼠的治疗效果及其机制，以期为肥胖治疗提供新的策略。

图6 大鼠肝脏细胞核Nrf2蛋白相对水平和NF-κB磷酸化相对水平变化

肥胖是全球性的健康问题，与多种代谢紊乱密切相关。目前的抗肥胖药物如奥利司他和氯卡色林虽显示出一定的效果，但伴随多种不良反应，如心血管毒性、头痛和肝脏不良事件(Yanovski and Yanovski,2014)。相比之下，柴胡皂苷A作为一种天然药物，具有更高的安全性和潜在的抗肥胖效果。在本研究中，柴胡皂苷A联合有氧运动显著减轻了肥胖大鼠的体重，改善了血脂参数，减少了肝脏脂肪积累，并观察到两者具有协同的抗肥胖效果。

氧化应激在肥胖的病理生理学中扮演关键角色。柴胡皂苷A联合有氧运动能有效上调肝脏的抗氧化酶活性，减少氧化产物的积累，并通过Nrf2途径促进了细胞核易位(Lüetal.,2019;Huangetal.,2023)。此外，柴胡皂苷A通过减轻炎症和维持细胞屏障的完整性来减轻由金黄色葡萄球菌诱导的小鼠乳腺炎(Zhao et al.,2023)，显示出其通过抑制NF-κB活化发挥抗炎作用的能力。

肥胖与慢性低度炎症状态密切相关。本研究发现，柴胡皂苷A联合有氧运动能有效下调肥胖大鼠肝脏中促炎细胞因子的水平，抑制NF-κB的磷酸化激活(Kim et al.,2015;Douglass et al.,2017;Ben et al.,2019)。此外，柴胡皂苷A处理的肥大3T3-L1脂肪细胞中观察到下调了TNF-α、IL-1β、IL-6等炎症因子的表达，进一步验证了其抗炎活性。

综上所述，本研究证实了柴胡皂苷A联合有氧运动在肥胖大鼠模型中的应用潜力。这种联合治疗通过激活Nrf2提高抗氧化活性，并通过抑制NF-κB通路发挥抗炎作用，有效改善了脂质代谢异常。此外，柴胡皂苷A和有氧运动的协同效应可能进一步增强其治疗效果，提供了一种潜在的、多机制的治疗策略，用于管理肥胖及其相关并发症。

基金资助:全国食品产业职业教育教学指导委员会2022年度教育教学改革与研究课题(SHK2022068)资助;

文章来源:韩延歌,孟宇竹,王丽娜.柴胡活性物质联合有氧运动对肥胖大鼠的治疗作用及其机制[J].分子植物育种,2024,22(16):5501-5509.