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白藜芦醇对糖尿病肾病大鼠JAK/STAT信号通路的影响

2024-06-20 13 上传者：管理员

摘要：目的研究白藜芦醇对糖尿病肾病大鼠JAK/STAT信号通路的影响。方法高糖高脂饲料喂养健康SD大鼠8周后，用链脲佐菌素45 mg/kg腹腔注射造模。将40只成模大鼠随机分为模型组、白藜芦醇低剂量组、白藜芦醇中剂量组、白藜芦醇高剂量组，每组10只。白藜芦醇低、中、高剂量组分别给予10 mg/kg、20 mg/kg、40 mg/kg白藜芦醇灌胃治疗，正常组和模型组则给予等容量蒸馏水。连续灌胃4周后，以HE染色观察肾脏组织形态学改变，并比较各组大鼠血糖、血清胆固醇、甘油三酯、尿素氮和肌酐水平。采用酶联免疫吸附法(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)检测血清细胞间黏附分子-1(intercellular adhesion molecule-1,ICAM-1)和白介素-6(interleukin-6,IL-6)水平；荧光定量PCR法检测肾组织两面神激酶2(Janus kinase 2,JAK2)、信号传导与转录激活因子3(signal transducer and activator of transcription 3,STAT3)、细胞因子信号抑制物1(suppressor of cytokine signaling 1,SOCS1)、ICAM-1和IL-6的mRNA水平；Western blot法检测肾组织磷酸化两面神激酶2(phosphorylated Janus kinase 2,p-JAK2)、磷酸化信号传导与转录激活因子3(phosphorylated signal transducer and activator of transcription 3,p-STAT3)、SOCS1、ICAM-1和IL-6的蛋白表达。结果经白藜芦醇治疗后，白藜芦醇各剂量组肾脏病理损伤减轻。与正常组比较，模型组大鼠血糖、血清胆固醇、甘油三酯、尿素氮、肌酐均升高(P均<0.05)。与模型组相比，白藜芦醇中、高剂量组大鼠血糖、血清胆固醇、甘油三酯、尿素氮和肌酐均降低(P均<0.05)。白藜芦醇各剂量组大鼠血清ICAM-1和IL-6均较模型组显著降低(P均<0.05),且白藜芦醇中、高剂量组大鼠血清ICAM-1和IL-6显著低于低剂量组(P均<0.05)。白藜芦醇各剂量组肾组织JAK2和STAT3的mRNA水平无明显变化(P>0.05),而p-JAK2和p-STAT3的蛋白表达均较模型组下降(P均<0.05);ICAM-1和IL-6的mRNA水平和蛋白表达均较模型组降低(P均<0.05),而SOCS1的mRNA水平和蛋白表达均较模型组升高(P均<0.05)。结论白藜芦醇能减轻糖尿病肾病大鼠的肾脏损害，控制其血糖、血脂，降低血清尿素氮和肌酐水平，其机制可能与抑制JAK/STAT信号通路有关。

关键词：
JAK/STAT信号通路
大鼠
白藜芦醇
糖尿病
糖尿病肾病
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糖尿病肾病是糖尿病最常见和最严重的并发症之一，也是糖尿病致死的主要原因。因此，控制和延缓糖尿病肾病的进展具有重要意义[1,2]。中药在改善糖尿病肾病临床症状，延缓病情进展等方面显示出良好疗效[3]。白藜芦醇是从治疗糖尿病的中药——虎杖中提取的活性成分，其功效显著且副作用小，临床应用广泛。近年来研究表明，白藜芦醇具有调节糖脂代谢、抗氧化、抗炎、抗肿瘤、抗心血管疾病等多种药理学作用[4]。研究发现，JAK/STAT信号通路通过调控多种炎症因子的表达，参与糖尿病损伤的发生发展[5];而白藜芦醇可通过抑制JAK/STAT信号通路活化，降低IgE、IL-4、IL-13等炎症介质的表达，减轻哮喘小鼠的气道炎症[6];然而有关白藜芦醇是否通过JAK/STAT信号通路在糖尿病肾病的治疗中发挥作用，目前未见相关报道。基于此，本研究探讨白藜芦醇对糖尿病肾病大鼠JAK/STAT信号通路的影响，现报道如下。

1、材料与方法

1.1 实验动物

50只健康SD大鼠，雄性，体质量200～250 g, 购自郑州大学实验动物中心，动物生产许可证号：SCXK(豫)2021-0009。

1.2 主要试剂

白藜芦醇(纯度>98%,上海同田生物);血糖、胆固醇、甘油三酯、尿素氮和肌酐测定试剂盒(南京建成生物工程研究所);大鼠ICAM-1和IL-6的ELISA试剂盒(武汉博士德生物工程有限公司);总RNA提取试剂盒、反转录试剂盒、荧光定量PCR试剂盒(大连宝生物工程有限公司);RIPA裂解液、BCA试剂盒、ECL试剂盒(北京天根生化公司);JAK2抗体、p-JAK2抗体、STAT3抗体、p-STAT3抗体、SOCS1抗体、ICAM-1抗体和IL-6抗体、β-actin抗体、羊抗兔IgG二抗(天津三箭生物技术有限公司)。

1.3 主要仪器

全自动生化分析仪(深圳迈瑞生物医疗有限公司);石蜡冰冻切片机(浙江金华市益迪医疗设备厂);光学显微镜(日本尼康公司);酶标仪(北京普朗有限公司);荧光定量PCR仪(美国赛默飞世尔科技公司);蛋白质印迹转膜仪、电泳仪、凝胶成像分析仪(北京六一生物科技有限公司)等。

1.4 造模及干预方法

50只健康雄性SD大鼠适应性喂养1周后，随机选取10只给予普通饲料，即为正常组，其余40只大鼠给予高糖高脂饲料喂养8周。禁食、不禁水12 h后给予高糖高脂饲料喂养的大鼠一次性腹腔注射45 mg/kg链脲佐菌素，造模72 h后测定血糖，血糖≥16.7 mmol/L即造模成功。将成模大鼠随机分为模型组、白藜芦醇低剂量组(10 mg/kg)、白藜芦醇中剂量组(20 mg/kg)、白藜芦醇高剂量组(40 mg/kg),每组10只。白藜芦醇各剂量组按照相应剂量灌胃给药治疗，正常组和模型组通过灌胃器吸取等容量蒸馏水灌胃，每日1次；连续干预4周后，于尾静脉取血，并取肾脏标本备用。

1.5 检测指标及方法

肾组织形态学观察：取部分大鼠肾脏组织，用10%多聚甲醛固定1周，梯度酒精水化，石蜡常规包埋、干燥后切片，切片厚度为4 μm, 烘片后经二甲苯脱蜡、梯度酒精水化、苏木精-伊红染色、梯度酒精脱水、二甲苯透明、中性树胶封片，于光学显微镜下观察肾脏组织的形态学变化。

血糖、血脂和肾功能测定：各组大鼠血液标本静置1 h后，以3000 r/min、离心15 min, 取血清，按照试剂盒要求，采用全自动生化分析仪检测各组大鼠血糖、胆固醇、甘油三酯、尿素氮和肌酐等生化指标。

血清ICAM-1和IL-6水平测定：按照ELISA试剂盒说明书的操作步骤，检测血清ICAM-1和IL-6水平。

荧光定量PCR检测肾组织JAK2、STAT3、SOCS1、ICAM-1和IL-6的mRNA水平：取冻存的肾脏组织，倒入液氮，研碎，加入Trizol裂解，按照RNA提取试剂盒的要求提取大鼠肾脏总RNA,用凝胶电泳检测总RNA的完整性，而RNA的浓度用A260/A280进行定量。按照反转录试剂盒要求合成cDNA。使用荧光定量PCR仪检测肾组织JAK2、STAT3、SOCS1、ICAM-1和IL-6的mRNA水平，扩增条件为：预变性95℃ 10 min, 1个循环；扩增95℃ 15 s, 60℃ 15 s, 72℃ 30 s, 40个循环，引物序列见表1。结果采用2-△△ct法进行分析。

表1 引物序列

Western blot检测肾组织p-JAK2、p-STAT3、SOCS1、ICAM-1和IL-6的蛋白表达：取大鼠肾脏组织，加入RIPA裂解液，于冰上研磨匀浆，以12000 r/min离心10 min, 取部分上清，以BCA法定量蛋白。取蛋白用10% SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，并转移至PVDF膜上，5%脱脂奶粉室温封闭1 h, 4℃摇床孵育一抗过夜，室温孵育二抗1 h, 洗涤后用ECL检测液显色，于凝胶成像系统中曝光并采集图片，使用Quantity One软件对目的蛋白灰度值进行分析，并计算目的蛋白灰度值与内参蛋白(β-actin)灰度值比值。比较各组肾脏组织p-JAK2、p-STAT3、SOCS1、ICAM-1和IL-6的蛋白表达情况。

1.6 统计学处理

采用SPSS 17.0统计学软件进行数据分析，计量资料用均数±标准差

表示。多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较用LSD检验。以P<0.05为差异具有统计学意义。

2、结果

2.1 动物一般情况和肾脏形态学改变

正常组大鼠精神状态良好，毛发有光泽，反应敏捷，饮食和尿量正常。其他各组大鼠则出现不同程度的精神差，毛发晦暗，进食多，饮水多，尿液增多。与模型组相比，白藜芦醇各剂量组大鼠反应变得灵敏，毛发也稍有光泽，进食量、饮水量和尿液量均减少。

如图1所示，正常组大鼠肾脏组织结构整齐，肾小球、肾小管形态正常。与正常组相比，模型组肾小球体积变小，出现明显的核固缩，肾小管管腔变大，肾小管上皮细胞空泡变性。与模型组相比，随着白藜芦醇剂量的增加，肾小球体积增大，核固缩减轻，肾小管上皮细胞轻度变性，肾小管管腔趋于正常。其中白藜芦醇高剂量组的肾小球与肾小管形态接近正常。

2.2 血糖、血脂水平比较

与正常组相比，模型组大鼠血糖、血清胆固醇和甘油三酯明显增高(P均<0.05)。与模型组相比，白藜芦醇中、高剂量组大鼠血糖、胆固醇和甘油三酯均降低(P均<0.05);白藜芦醇低剂量组胆固醇和甘油三酯差异无统计学意义(P>0.05)。与白藜芦醇低剂量组相比，白藜芦醇中、高剂量组大鼠血糖、胆固醇和甘油三酯均降低(P均<0.05)。见表2。

2.3 肾功能指标比较

与正常组相比，模型组大鼠血清尿素氮和肌酐水平明显增高(P均<0.05)。与模型组相比，白藜芦醇各剂量组大鼠血清尿素氮和肌酐水平明显降低(P均<0.05)。与白藜芦醇低剂量组相比，白藜芦醇中、高剂量组的血清尿素氮和肌酐水平均降低(P均<0.05)。见表3。

图1 各组大鼠肾组织病理学改变(HE染色，×400)

A:正常组；B:模型组；C:白藜芦醇低剂量组；D:白藜芦醇中剂量组；E:白藜芦醇高剂量组。

表2 各组大鼠血糖、血清胆固醇和甘油三酯比较

2.4 血清ICAM-1和IL-6水平比较

与正常组相比，模型组大鼠血清ICAM-1和IL-6水平明显增高(P均<0.05)。与模型组相比，白藜芦醇各剂量组大鼠血清ICAM-1和IL-6水平均降低(P均<0.05)。与白藜芦醇低剂量组相比，白藜芦醇中、高剂量组的ICAM-1和IL-6水平均降低(P均<0.05)。见表4。

2.5 肾组织JAK2、STAT3、SOCS1、ICAM-1和IL-6的mRNA水平比较

与正常组相比，模型组大鼠肾组织JAK2和STAT3的mRNA表达量差异无统计学意义(P>0.05),但SOCS1、ICAM-1和IL-6的mRNA表达明显升高(P均<0.05)。与模型组相比，白藜芦醇各剂量组JAK2和STAT3的mRNA表达差异无统计学意义(P>0.05),SOCS1的mRNA表达明显升高(P<0.05),ICAM-1和IL-6的mRNA表达明显降低(P均<0.05),并呈现剂量依赖效应。见表5。

2.6 肾组织p-JAK2、p-STAT3、SOCS1、ICAM-1和IL-6的蛋白表达比较

与正常组相比，模型组大鼠肾组织p-JAK2、p-STAT3、SOCS1、ICAM-1和IL-6的蛋白表达明显升高(P均<0.05)。与模型组相比，白藜芦醇各剂量组p-JAK2、p-STAT3、ICAM-1和IL-6的蛋白表达降低(P均<0.05),SOCS1的蛋白表达随着白藜芦醇浓度的增加而升高(P<0.05)。见图2和表6。

表3 各组大鼠血清尿素氮和肌酐水平比较

表4 各组大鼠血清ICAM-1和IL-6水平比较(n=10,pg/mL,

表5 各组大鼠肾组织JAK2、STAT3、SOCS1、ICAM-1和IL-6的mRNA表达比较

图2 各组大鼠p-JAK2、p-STAT3、SOCS1、ICAM-1和IL-6的蛋白表达

3、讨论

糖尿病肾病是糖尿病常见的并发症之一，其发病机制复杂，与糖脂代谢紊乱、血流动力学改变、氧化应激反应和炎症因子激活等有关[7],目前还缺乏特效药物治疗。白藜芦醇是非黄酮类多酚化合物，广泛存在于虎杖、花生和葡萄等植物中。白藜芦醇能够抑制肾小管上皮细胞的氧化应激，减轻肾脏的炎症损伤，在糖尿病、血脂异常等病症的治疗中具有较好的效果[8]。本研究中，白藜芦醇可明显降低糖尿病肾病大鼠血糖、血清胆固醇和甘油三酯等水平，提示白藜芦醇可以延缓糖尿病的发展。尿素氮和肌酐是反映肾功能的常用指标。本研究中，糖尿病肾病大鼠血清尿素氮和肌酐含量明显升高；且肾脏病理损伤明显，肾小球体积变小、出现明显的核固缩，肾小管管腔变大，肾小管上皮细胞空泡变性。经白藜芦醇治疗后，肾小球体积增大、核固缩减轻，肾小管管腔趋于正常，肾小管上皮细胞轻度变性，且白藜芦醇高剂量组的肾小球与肾小管形态接近正常；提示白藜芦醇可明显减轻糖尿病肾病大鼠的肾脏损伤。

炎症反应在糖尿病肾病的发展过程中具有重要作用，糖尿病患者肾脏中最主要的炎症浸润细胞是单核/巨噬细胞，而促进单核/巨噬细胞进入肾脏的主要炎症因子是ICAM-1。升高的ICAM-1可以促进糖尿病患者肾脏的炎症反应，引起肾脏损伤[9]。进入肾脏的单核细胞可以活化为巨噬细胞，并分泌多种促炎因子，如IL-6、单核细胞趋化因子、ICAM-1等[10]。因此，抑制ICAM-1和IL-6等炎症因子的表达可以延缓糖尿病肾病的发展。本研究发现，白藜芦醇可明显降低血清ICAM-1和IL-6水平，提示白藜芦醇可减轻糖尿病肾病大鼠的全身炎症反应。

JAK/STAT信号通路可调控多种炎症因子的表达，参与糖尿病损伤的发生发展。糖尿病肾病大鼠的高血糖会刺激机体产生多种细胞因子并作用于JAK2受体，进而影响下游底物STAT3,促进炎症的发生[11]。IL-6就是众多细胞因子之一。IL-6可激活并结合JAK2,使其形成二聚体，继而磷酸化为p-JAK2。p-JAK2可激活下游的STAT3,使之磷酸化为p-STAT3,并发生基因的转录和表达，促进炎症因子如IL-6和ICAM-1等的产生，增多的炎症因子又激活JAK/STAT信号通路，形成恶性循环，导致炎症反应持续存在，加剧机体损伤。SOCS1蛋白可结合到JAK2上，阻止JAK2的磷酸化，起负调控作用[12]。

本研究发现，各组大鼠肾组织JAK2和STAT3的mRNA水平和蛋白表达差异无统计学意义，但是，与正常组相比，模型组大鼠p-JAK2和p-STAT3表达上调，说明糖尿病肾病大鼠的高血糖并没有刺激JAK2及STAT3的基因表达，而是磷酸化为p-JAK2和p-STAT3,进而激活STAT3依赖的目的基因的转录和翻译，导致炎症的发生，从而促进糖尿病肾病的发展。本研究中，与正常组相比，模型组大鼠的肾组织SOCS1的mRNA水平和蛋白表达均明显上调，这可能是由于JAK/STAT信号通路的激活，造成SOCS1表达增多，但增多的SOCS1不足以抑制炎症因子的产生，因此模型组大鼠IL-6和ICAM-1的mRNA水平和蛋白表达均增高。经白藜芦醇治疗后，SOCS1过表达进一步增多，才能够阻止JAK/STAT信号通路的激活，抑制炎症因子IL-6和ICAM-1的表达，阻止炎症反应的发生，以减轻糖尿病损伤。

综上所述，白藜芦醇可控制糖尿病肾病大鼠的血糖、血脂，降低血清尿素氮和肌酐水平，减轻肾脏的病理学损伤，改善糖尿病肾病大鼠的肾脏功能，其机制可能是通过提高SOCS1水平，抑制JAK2和STAT3的磷酸化，从而减轻糖尿病肾病大鼠的炎症反应。

参考文献:

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基金资助:2020年度河南省高等职业学校青年骨干教师培养计划项目(No.2020GZGG035); 南阳市2021年科技发展计划项目(No.KJGG120);

文章来源:刘庆春,张峰.白藜芦醇对糖尿病肾病大鼠JAK/STAT信号通路的影响[J].中西医结合研究,2024,16(03):178-183.