膝骨关节炎(osteoarthritis, OA)是发生于膝关节的一种退行性慢性关节病，在骨科临床上很常见，其临床表征主要是关节肿胀、疼痛与进行性功能障碍，可造成患者活动受限，进而极大影响其正常生活工作[1-2]。

滑膜炎症、软骨丢失及软骨下骨重塑等是OA的主要病理特征，通过调控巨噬细胞极化来阻止炎症发生发展，可有效改善OA患者临床症状[3-4]。核转录因子-κB(nuclear transcription factor-κB,NF-κB)是机体主要的炎症调控信号之一，可通过调控巨噬细胞极化而介导包括OA在内的炎症性疾病的发生发展，抑制NF-κB信号通路激活可防止M1型巨噬细胞极化，降低炎症水平，并抑制破骨细胞分化，进而减轻强直性脊柱炎引起的骨破坏[5],降低NF-κB信号活性可通过诱导巨噬细胞极化从M1表型转变为M2表型而对OA体外细胞模型发挥抗炎和抗凋亡作用，并减轻OA小鼠软骨破坏和滑膜炎症[6-7],由此可知靶向抑制NF-κB信号通路激活是OA的潜在治疗手段。吴茱萸碱(evodiamine, EV)是从吴茱萸中提取的吲哚类喹唑啉生物碱，能起到明显的抑制炎症、氧化应激和细胞凋亡的功效，可有效减轻脂多糖诱导的髓核细胞炎症、凋亡和细胞外基质降解[8],EV还可通过抑制NF-κB磷酸化及其向细胞核的易位而阻止炎症的发生发展[9],还可减轻OA小鼠软骨细胞炎症和体内软骨退化[10],因而推测通过抑制NF-κB信号通路激活传导而阻止M1型巨噬细胞极化，进而减轻炎症可能是EV治疗OA的作用机制。

本文通过建立膝骨OA大鼠模型，探究EV调节NF-κB通路对巨噬细胞极化的影响。

1、材料与方法

1.1 实验动物

SD大鼠，SPF级，体重(210±20)g, 6周龄左右，雄性，饲养在屏障环境级别的动物房中，饲养环境：温度(22±2)℃、照明12 h/12 h明暗周期交替、相对湿度(50±10)%,所有大鼠均购自上海吉辉实验动物饲养有限公司，生产许可证号为SCXK(沪)2022-0009。

1.2 主要试剂及仪器

碘乙酸钠(sodium iodoacetate, MIA)购自大连美仑生物技术有限公司，货号：MB8128-1,纯度>98%;EV购自上海颖心实验室设备有限公司，货号：TX00721,纯度≥98%;佛波醇12-肉豆蔻酸酯13-乙酸酯(phorbol 12-myristate 13-acetate, PMA)购自美国MCE公司，货号：HY-18739,纯度：99.07%;大鼠FITC-CD45、APC-CD163和PE-CD68抗体、大鼠白细胞介素(interleukin, IL)-1β、IL-6与IL-1 ELASA试剂盒、HE染色试剂盒、HRP-IgG二抗(驴抗兔)购自英国Abcam公司；改良番红O-固绿软骨染色试剂盒购自上海尚宝生物科技有限公司；兔源抗大鼠anti-核因子κB抑制因子α(inhibitor of NF-κB α,IκB-α)、anti-NF-κB p65、anti-p-IκB-α、anti-p-NF-κB p65与anti-β-actin一抗购自上海碧云天生物技术有限公司等。

电子压痛仪购自济南益延科技发展有限公司(中国),型号：YLS-3E;冷冻病理切片机购自山东海卓尔光电科技有限公司(中国),型号：LD-4080;生物显微镜购自Nikon公司(日本),型号：YS-100;流式细胞分析仪购自上海贝克曼库尔特国际贸易有限公司(中国),型号：CytoFLEX S;酶标仪购自BioTek公司(美国),型号：800TS;蛋白垂直电泳及转印系统购自Bio-Rad公司(美国),型号：1658033。

1.3 建立膝骨OA大鼠模型并分组给药

参照文献[11]方法通过关节腔内注射碘乙酸钠(MIA)的方法建立膝骨OA模型：取SD大鼠，于其腹腔内注射1%戊巴比妥钠溶液，注射体积为0.6 mL/100 g, 待大鼠被麻醉后对其右膝关节脱毛并消毒，屈曲膝关节90°并触摸定位髌骨、股骨髁及髌韧带，使用微量注射器将针头紧贴髌韧带两侧髌骨下方向股骨髁方向进针，有明显落空感时即表示针头已进入关节腔内，向其中注入MIA溶液50 μL(含1 mg的MIA),然后按摩膝关节来促使溶液分布均匀，7 d后可观察到大鼠膝关节发生明显肿胀、疼痛，且大鼠发生跛行，表明膝骨OA模型建立成功，随机分为模型组、EV低剂量组、EV高剂量组、EV高剂量+PMA组，每组10只，另取10只大鼠以同样方法向其关节腔内注射等量生理盐水作为对照组。

膝骨OA模型建立成功后分组干预大鼠：EV和PMA分别溶于生理盐水，制成EV药液(浓度分别为13.8 μg/μL、27.6 μg/μL)、EV(浓度为27.6 μg/μL)及PMA(浓度为0.004 μg/μL)混合药液。EV低剂量(6.9 mg/kg)组、EV高剂量(13.8 mg/kg)组大鼠分别于其关节腔内注射13.8 μg/μL和27.6 μg/μL的EV药液[10],注射体积为50 μL/100 g, 每天注射1次；EV高剂量(13.8 mg/kg)+PMA[12](2 μg/kg)组大鼠于其关节腔内注射EV及PMA混合药液，注射体积为50 μL/100 g, 每天注射1次；模型组、对照组大鼠于其关节腔内注射生理盐水，注射体积为50 μL/100 g, 每天注射1次，各组大鼠均干预2周。

1.4 检测各组大鼠关节压痛阈值、关节肿胀率、关节活动度与步态评分

关节压痛阈值：各组给药完成后24 h, 取各组大鼠放入圆桶中固定，将电子压痛仪的探头放置在大鼠患肢足背处按压，当大鼠挣扎或鸣叫时表明大鼠出现疼痛反应，记录此时压力值即获得大鼠关节压痛阈值。

关节肿胀率：采用绕线法测量造模前各组大鼠患肢足踝关节周长(记为L1),然后在关节压痛阈值检测结束后再次测量其患肢足踝关节周长(记为L2),计算各组大鼠关节肿胀率，公式：关节肿胀率(%)=(L2-L1)/L1×100%。

观察大鼠活动时的步态并根据参考文献[13]中的标准进行评分：大鼠步态正常，0分；大鼠轻度跛行，患肢膝关节下略有弯曲，1分；大鼠中度跛行，患肢刚触到地面，2分；大鼠重度跛行，患肢离开地面且其余三足着地行走，3分。

关节活动度：步态评分结束后用刻度量角器测量各组大鼠在外力作用下膝关节从伸展到回缩的最大角度，即为其关节活动度。

1.5 HE染色检测各组大鼠软骨与滑膜组织病理形态并采集标本

以5%异氟醚麻醉大鼠后抽取其颈动脉血及关节腔内积液，4℃下离心后取上清获得血液与关节液样本，存于-80℃冰柜中，用于后续促炎因子水平检测；每组随机取5只大鼠颈椎脱臼处死，剪下患肢打开关节腔，分离出软骨滑膜组织并用快进千分尺测量其厚度，取其膝关节软骨与滑膜组织各0.3 g左右，分别放置在预冷放射免疫沉淀测定(radio-immunoprecipitation assay, RAPI)试剂中，按试剂说明书提取蛋白，以BCA法测定浓度后将所得软骨与滑膜组织蛋白样品液存于-80℃冰柜中，用于后续蛋白表达检测；再取膝关节软骨与滑膜组织投入最佳切削温度复合物(optimal cutting temperature compound, OCT)试剂中包埋，以液氮冷冻后切片(厚度5～8 μm),然后复温、固定、行番红O-固绿(染软骨组织)或HE(染滑膜组织)染色、镜下观察，采集各组关节软骨及滑膜组织形态图像。

根据关节软骨损伤等级和损伤阶段进行关节炎评分[13],损伤等级：软骨表面完好无损，0级；软骨表面完整但发生水肿、增生、纤维性颤动，1级；软骨表面不连续有基质损失，2级；软骨表面有垂直向裂缝，3级；软骨表面有侵蚀，浅层区发生分层，基质丢失，4级；软骨表面剥蚀并存在修复组织，5级；软骨表面变形，关节有骨赘形成，6级。损伤阶段：软骨无损伤，0阶；软骨损伤区少于10%,1阶；软骨损伤区为10%～,2阶；软骨损伤区为26%～,3阶；软骨损伤区大于50%,4阶；关节炎评分=软骨损伤等级×损伤阶段。

根据滑膜组织增生、炎性浸润的病变程度做滑膜病理评分[11]:无病变，0分；病变从轻度到重度，1～3分；总分最大为6分。

1.6 流式细胞术检测各组大鼠关节滑膜组织巨噬细胞极化

将各组剩余的5只大鼠颈椎脱臼处死，剪下患肢打开关节腔，分离出软骨滑膜组织剪碎、胶原酶消化为单个细胞，以PBS洗涤后制为5×105个/mL的细胞悬液，每组取500 μL加入大鼠FITC-CD45、APC-CD163抗体避光孵育，以PBS洗涤后置于流式细胞分析仪内检测M2型巨噬细胞占比；再次取500 μL各组大鼠滑膜组织单细胞悬液，加入大鼠FITC-CD45、PE-CD68抗体避光孵育，以PBS洗涤后置于流式细胞分析仪内检测M1型巨噬细胞占比，然后计算M1/M2比值。

1.7 ELISA法检测各组大鼠血清与关节液中促炎因子水平

取出-80℃冰柜中的各组大鼠血清与关节液置于4℃冰箱中，慢慢解冻后采用ELISA法测定其中促炎因子IL-6、IL-1、IL-1β水平，测定步骤依照各自ELISA试剂盒说明书进行。

1.8 免疫印迹检测大鼠关节软骨与滑膜组织NF-κB通路相关蛋白表达

取出-80℃冰柜中的各组大鼠关节软骨与滑膜组织蛋白样品液置于4℃冰箱中，慢慢解冻后加入等体积上样缓冲液混匀，以沸水浴使其中蛋白变性后每组取软骨、滑膜组织蛋白样本各20 μg, 加入浓缩胶上样孔中在120 V恒压下电泳，蛋白分离开后在40 mA稳定电流下湿转，蛋白印迹转移到PVDF膜上后用5%脱脂牛奶封闭其非特异抗原，将各组软骨、滑膜组织p-IκB-α、p-NF-κB p65、β-actin、IκB-α、NF-κB p65蛋白自膜上剪下，分别孵育对应兔源一抗后用HRP-IgG二抗(驴抗兔)行抗原抗体反应，经化学发光法显色后定影，扫描获取各组蛋白图像并用图像处理软件Image J定量蛋白灰度值，以内参β-actin为基准得出各组软骨、滑膜组织p-IκB-α、p-NF-κB p65、IκB-α、NF-κB p65蛋白相对表达量，最后计算p-IκB-α/IκB-α、p-NF-κB p65/NF-κB p65比值来评估IκB-α、NF-κB p65的磷酸化水平。

1.9 统计学方法

本实验数据采用GraphPad Prism 8.0软件进行统计分析，计量资料符合正态分布，以平均数±标准差

来描述，多组间均数比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用SNK-q检验，以P<0.05为差异具有统计学意义。

2、结果

2.1 EV对各组大鼠关节疼痛与肿胀率的影响

与对照组比较，模型组大鼠关节压痛阈值明显降低(P<0.05),关节肿胀率明显升高(P<0.05);与模型组比较，EV低剂量组、EV高剂量组大鼠关节压痛阈值均升高(均P<0.05),关节肿胀率均降低(均P<0.05);与EV低剂量组比较，EV高剂量组大鼠关节压痛阈值升高(P<0.05),关节肿胀率降低(P<0.05);与EV高剂量组比较，EV高剂量+PMA组大鼠关节压痛阈值降低(P<0.05),关节肿胀率升高(P<0.05)。见表1。

2.2 EV对各组大鼠关节活动度与步态评分的影响

与对照组比较，模型组大鼠关节活动度明显降低(P<0.05),步态评分明显升高(P<0.05);与模型组比较，EV低剂量组、EV高剂量组大鼠关节活动度均升高(均P<0.05),步态评分均降低(均P<0.05);与EV低剂量组比较，EV高剂量组大鼠关节活动度升高(P<0.05),步态评分降低(P<0.05);与EV高剂量组比较，EV高剂量+PMA组大鼠关节活动度降低(P<0.05),步态评分升高(P<0.05)。见表2。

与对照组比较，#P<0.05;与模型组比较，*P<0.05;与EV低剂量组比较，△P<0.05;与EV高剂量组比较，&P<0.05

表1各组大鼠关节压痛阈值、关节肿胀率

表2各组大鼠关节活动度、步态评分

2.3 EV对各组大鼠关节软骨与滑膜组织病理形态的影响

对照组大鼠关节软骨与滑膜组织形态正常无损伤。模型组大鼠关节软骨与滑膜组织形态发生明显病理损伤：软骨表面断裂、破损并发生纤维化，软骨基质缺失有裂隙出现，滑膜发生增生并存在大量炎性细胞浸润，软骨病理评分、滑膜厚度、滑膜病理评分相比对照组明显升高(均P<0.05)。与模型组相比，EV低剂量组、EV高剂量组大鼠关节软骨与滑膜组织病理损伤均减轻，软骨病理评分、滑膜厚度、滑膜病理评分均降低(均P<0.05)。与EV低剂量组比较，EV高剂量组大鼠关节软骨与滑膜组织病理损伤进一步减轻，软骨病理评分、滑膜厚度、滑膜病理评分进一步降低(均P<0.05);与EV高剂量组比较，EV高剂量+PMA组大鼠关节软骨与滑膜组织病理损伤加重，软骨病理评分、滑膜厚度、滑膜病理评分升高(均P<0.05)。见图1、图2、表3。

图1番红O-固绿染色检测各组大鼠关节软骨组织病理形态

图2HE染色检测各组大鼠关节滑膜组织病理形态

表3各组大鼠软骨病理评分、滑膜厚度、滑膜病理评分

2.4 EV对各组大鼠关节滑膜组织巨噬细胞极化的影响

与对照组比较，模型组大鼠滑膜组织M1型巨噬细胞占比、M1/M2比值明显升高(均P<0.05),M2型巨噬细胞占比稍有升高但差异无统计学意义(P>0.05);与模型组比较，EV低剂量组、EV高剂量组大鼠滑膜组织M2型巨噬细胞占比均升高(均P<0.05),M1型巨噬细胞占比、M1/M2比值均降低(均P<0.05);与EV低剂量组比较，EV高剂量组大鼠滑膜组织M2型巨噬细胞占比升高(P<0.05),M1型巨噬细胞占比、M1/M2比值降低(均P<0.05);与EV高剂量组比较，EV高剂量+PMA组大鼠滑膜组织M2型巨噬细胞占比降低(P<0.05),M1型巨噬细胞占比、M1/M2比值升高(均P<0.05)。见图3、表4。

2.5 EV对各组大鼠血清与关节液中促炎因子水平的影响

与对照组比较，模型组大鼠血清与关节液中IL-6、IL-1、IL-1β水平明显升高(均P<0.05);与模型组比较，EV低剂量组、EV高剂量组大鼠血清与关节液中IL-6、IL-1、IL-1β水平均降低(均P<0.05);与EV低剂量组比较，EV高剂量组大鼠血清与关节液中IL-6、IL-1、IL-1β水平降低(均P<0.05);与EV高剂量组比较，EV高剂量+PMA组大鼠血清与关节液中IL-6、IL-1、IL-1β水平升高(均P<0.05)。见表5。

图3流式细胞实验检测各组大鼠关节滑膜组织巨噬细胞极化

表4各组大鼠滑膜组织M1、M2型巨噬细胞占比与M1/M2比值

表5各组大鼠血清与关节液中IL-6、IL-1、IL-1β水平

2.6 EV对各组大鼠关节软骨与滑膜组织NF-κB通路相关蛋白表达的影响

与对照组比较，模型组大鼠软骨与滑膜组织p-IκB-α/IκB-α、p-NF-κB p65/NF-κB p65明显升高(均P<0.05);与模型组比较，EV低剂量组、EV高剂量组大鼠软骨与滑膜组织p-IκB-α/IκB-α、p-NF-κB p65/NF-κB p65均降低(均P<0.05);与EV低剂量组比较，EV高剂量组大鼠软骨与滑膜组织p-IκB-α/IκB-α、p-NF-κB p65/NF-κB p65降低(均P<0.05);与EV高剂量组比较，EV高剂量+PMA组大鼠软骨与滑膜组织p-IκB-α/IκB-α、p-NF-κB p65/NF-κB p65升高(均P<0.05)。见图4、图5、表6。

图4免疫印迹法检测大鼠关节软骨组织NF-κB通路相关蛋白表达

图5免疫印迹法检测大鼠关节滑膜组织NF-κB通路相关蛋白表达

3、讨论

OA作为一种在老年人群中发病率很高的慢性关节疾病，其发病率随着我国人口老年化的深入发展而不断升高，给我国医疗卫生系统造成了沉重的负担，因此积极探索有效治疗手段来改善OA患者预后具有重要社会意义[14-15]。关节内炎症是OA发生发展的主要病理基础，巨噬细胞作为机体重要的免疫细胞，受到刺激时可极化为不同的表型，M1型巨噬细胞可分泌促炎因子，可诱发并加重炎症，M1型巨噬细胞具有抗炎与促使组织修复的作用，巨噬细胞发生M1型极化是关节炎症发生发展的主要因素，阻止巨噬细胞M1型极化并促进其M2型极化可在体内外有效减轻软骨细胞炎症损伤，是治疗OA的有效途径[3-4,16]。EV是吴茱萸中含有的具有抗炎功效的生物碱成分，可通过抑制NF-κB p65的磷酸化从而抑制炎症，从而显著减轻脂多糖诱导的小鼠乳腺炎[17],还可减轻脂多糖诱导的小鼠中脑神经元-胶质细胞炎症反应和多巴胺能神经元的损失[18],另外口服EV可通过抑制炎症细胞浸润、滑膜细胞增殖、和软骨侵蚀来显著减轻OA大鼠滑膜炎症和骨损伤[19],但巨噬细胞极化是否参与介导EV对OA的治疗过程，目前还不清楚。本文通过关节腔内注射MIA的方法建立大鼠膝骨OA模型，结果显示造模大鼠发生跛行，且膝关节发生明显肿胀、疼痛，提示大鼠膝骨OA模型建立成功。另外，相比对照组大鼠，OA大鼠软骨与滑膜组织形态发生明显病理损伤，关节压痛阈值、关节活动度明显降低，关节肿胀率、滑膜厚度、步态评分、软骨关节炎评分、滑膜病理评分、滑膜组织M1型巨噬细胞占比与M1/M2比值、血清与关节液中IL-6、IL-1、IL-1β水平明显升高，表明在OA大鼠发病过程中，巨噬细胞活化并发生M1型极化，促使促炎因子表达分泌，引发炎症反应，造成大鼠滑膜增生，软骨与滑膜组织炎症损伤，并引发大鼠关节肿胀、疼痛、活动功能损伤等OA症状，以不同剂量EV处理OA大鼠，可减轻其上述病理改变，促使M2型巨噬细胞极化并抑制M1型巨噬细胞极化，表明EV可通过调节巨噬细胞极化过程而抑制炎症反应，进而减轻OA大鼠软骨与滑膜组织炎症损伤，改善其滑膜增生与关节肿胀、疼痛、活动功能障碍等OA症状，且高剂量EV对OA大鼠的上述治疗作用更强。

与对照组比较，#P<0.05;与模型组比较，*P<0.05;与EV低剂量组比较，△P<0.05;与EV高剂量组比较，&P<0.05

表6各组大鼠关节软骨与滑膜组织NF-κB通路相关蛋白相对表达

NF-κB作为重要的炎症调控信号因子，在巨噬细胞极化过程中可起到重要调控作用，进而通过调节M1型巨噬细胞极化引发的炎症来参与介导OA的发生发展，IκB-α是NF-κB的抑制因子，促使其磷酸化可增强其降解，刺激NF-κB p65发生磷酸化，进而促使NF-κB向细胞核内转移并激活炎症基因转录表达，是NF-κB信号调控OA发生过程中炎症的主要分子机制[12],抑制NF-κB信号通路激活能有效抑制M1型巨噬细胞极化及促炎因子分泌，进而减轻OA小鼠滑膜炎并缓解其膝关节疼痛[20],还可通过抑制破骨细胞激活而防止OA大鼠以骨吸收为主的软骨下骨重塑和进行性软骨丢失[21]。本研究结果显示OA大鼠软骨与滑膜组织p-IκB-α/IκB-α、p-NF-κB p65/NF-κB p65相比对照组均升高，表明NF-κB信号在OA大鼠发病过程中处于异常激活状态，以EV处理可减轻NF-κB信号通路相关蛋白的上述变化趋势，逆转其异常激活状态，揭示NF-κB信号通路参与介导EV对OA大鼠巨噬细胞极化的调控过程；以EV和NF-κB信号通路激活剂PMA联合处理，可减弱EV单独处理对OA大鼠M2型巨噬细胞极化的增强及对M1型巨噬细胞极化的抑制作用，拮抗其对OA大鼠的抗炎作用，削弱其对OA大鼠软骨与滑膜组织炎症损伤的减轻作用，逆转其对OA大鼠滑膜增生与关节肿胀、疼痛、活动功能障碍症状的改善作用，揭示EV调控巨噬细胞极化、抑制炎症并减轻OA大鼠临床症状是通过抑制NF-κB信号通路激活实现的。

综上所述，EV可减弱IκB-α、NF-κB p65的磷酸化，进而抑制M1型巨噬细胞极化并促进M2型巨噬细胞极化，减轻滑膜增生与滑膜炎症，缓解炎症造成的OA大鼠软骨与滑膜组织损伤，改善其关节肿胀、疼痛、活动功能减退症状，阻止NF-κB信号通路激活可能是EV调控巨噬细胞极化并治疗OA大鼠的作用机制，本文进一步证实了EV对OA的治疗潜力，并对其作用机制进行了探讨，有助于其在临床中的推广应用，对于OA患者预后的提升可起到一定积极作用。

参考文献:

[11]王成,袁君,郭彦玎,等.艾灸"足三里"对膝关节骨关节炎与类风湿性关节炎大鼠膝关节滑膜巨噬细胞极化的影响的比较研究[J].针刺研究,2023,48(10):993-1000.

[13]李志娟,王鑫,孙敬青,等.火针对膝骨关节炎大鼠关节功能及炎性反应的影响[J].针刺研究,2020,45(3):220-226.

基金资助:国家自然科学基金资助项目(No.82302773);

文章来源:王强,冯靖,谭章勇,等.吴茱萸碱调节NF-κB通路对膝骨关节炎巨噬细胞极化的影响[J].华中科技大学学报(医学版),2024,53(04):444-451.