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二代测序技术检测鼻咽癌相关基因突变与临床病理特征关系分析

2021-03-05 232 上传者：管理员

摘要：目的:以二代测序(NGS)为基础分析鼻咽癌相关基因突变及突变功能区域,探讨突变基因与临床特征之间的关系及临床应用价值。方法:收集2018年2月-2018年11月中南大学湘雅医学院附属肿瘤医院/湖南省肿瘤医院头颈放疗二科28例初治鼻咽癌患者,采用基因测序平台IlluminaNextSeqCN500进行全基因测序,描述基因检测结果,统计分析高频突变基因与临床病理特征之间的关系。结果:本研究共检测到93个基因及115个突变功能区域,因部分基因突变频率较低未纳入统计,纳入统计共20个突变基因及14个突变功能区域,其中泛素羧基末端水解酶1(BAP1)和肿瘤抑制因子(CYLD)基因的突变频率均为9.8%(5/51),肿瘤蛋白p53(TP53)基因突变频率为7.8%(4/51)。结论:IlluminaNextSeqCN500测序平台可作为鼻咽癌多基因突变检测手段,BAP1、CYLD及TP53在鼻咽癌中突变频率较高,对深入研究鼻咽癌发病机制及靶向药物治疗方面具有一定的指导意义。

关键词：
BAP1
CYLD
TP53
二代测序
鼻咽癌
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鼻咽癌是具有地区聚集性、种族易感性和家族遗传倾向的头颈部恶性肿瘤,随着放疗技术的进步和化疗方案的改善,鼻咽癌患者的生存率较前提高,但仍有20%的患者出现远处转移和局部复发。NGS是目前指导晚期肿瘤用药的技术之一,它能够同时检测多基因、多位点突变、融合基因、基因拷贝数变化(CNV)及碱基改变等。本研究为进一步明确鼻咽癌患者基因突变情况,利用NGS技术对28例初治鼻咽癌进行全基因检测,初步分析高频突变基因与临床特征之间的关系,以期为鼻咽癌发病机制及靶向药物治疗提供新思路。

1、材料与方法

1.1研究对象

2018年2月-2018年11月在中南大学湘雅医学院附属肿瘤医院/湖南省肿瘤医院头颈放疗二科住院病人中,收集28例初治鼻咽癌患者活检组织标本,其中男性19例,女性9例。根据鼻咽癌UICC/AJCC分期标准第8版,其中Ⅱ期1人、Ⅲ期16人、Ⅳa期10人及Ⅳb期1人。纳入标准:(1)病理分型为WHOⅡ-Ⅲ型;(2)均为初治鼻咽癌患者。排除标准:(1)既往接受过放化疗;(2)不能耐受鼻咽部活检。本研究符合《世界医学会赫尔辛基宣言》相关要求且经医院伦理委员会审批通过,所有研究对象均签署知情同意书。

1.2研究方法

患者治疗前鼻咽部活检组织石蜡包埋后均采用基因测序平台IlluminaNextSeqCN500测序方法,DNA提取和标捕获测序使用QIAampDNAFFPE组织试剂盒(Qiagen,Hilden,Germany)提取福尔马林固定石蜡包埋(FFPE)样品。使用Qubit荧光剂(Invitrogen,Carlsbad,CAUSA)和QubitdsDNAHS(HighSensitivity)检测试剂盒测量DNA浓度。使用IlluminaTruSeqDNA文库制备试剂盒(Illumina,SanDiego,CA)中推荐的方案制备文库构建,使用超声仪剪切的1μgDNA产生峰250bps的片段,然后进行末端修复,拖尾和连接。将文库与定制的生物素化寡核苷酸探针杂交(RocheNimbleGen,Madison,WI,USA),覆盖约1.1Mbp的序列。使用HiSeq3000测序系统(Illumina,SanDiego,CA)进行DNA测序,并具有2×100bp的配对末端读数。对288个基因的全部外显子,38个基因的内含子,启动子或融合断点区域,728个基因的编码区域进行目标区域捕获高深度测序,对肿瘤基因四种变异类型(包括点突变、小片段的插入缺失、拷贝数变异和目前已知的融合基因)进行检测。活检组织标本交由北京吉因加科技有限公司进行检测。

1.3统计学方法

应用SPSS25.0统计软件,计数资料以构成比、发生率表示,采用χ2检验或Fisher's精确概率法分析突变基因与临床特征之间的关系,P<0.05为差异有统计学意义。

2、结果

2.128例初治鼻咽癌患者不同病理类型基因突变NGS检测结果

本研究共检测到93个基因及115个突变功能区域,因部分基因突变频率较低未纳入统计,纳入统计的共20个突变基因及14个突变功能区域,其中BAP1和CYLD基因的突变频率均为9.80%(5/51),TP53基因突变频率为7.84%(4/51)。非角化性未分化型鼻咽癌中BAP1基因突变频率为10.26%(4/39),CYLD和TP53基因的突变频率均为7.69%(3/39)。非角化性分化型鼻咽癌中BAP1和TP53基因的突变频率均为8.33%(1/12),CYLD基因的突变频率为16.67%(2/12)。具体各基因突变分析,见图1和表1。

2.228例初治鼻咽癌患者NGS检测BAP1、CYLD、TP53基因位点突变结果

BAP1、CYLD均检出5个突变位点,均为单位点突变,TP53检出4个突变位点,为单位点突变。BAP1的4号外显子c.144C[2>1]移码突变,7号外显子c.496G>A错义突变,8号外显子c.587G[6>7]移码突变,13号外显子c.1471G>T无义突变及16号外显子c.1987G>A错义突变,突变频率分别为:46.70%,5.80%,13.00%,76.10%及18.20%。CYLD的7号外显子c.1103C>A无义突变,9号外显子c.1064A>G错义突变,11号外显子c.1849GT[2>1]移码突变,15号外显子c.2290A[7>6]移码突变及18号外显子c.2704C>T无义突变,突变频率分别为:40.20%,4.10%,22.10%,7.70%及33.50%。TP53的4号外显子c.272G>A无义突变,8号外显子c.916C>T无义突变,c.811G>A错义突变,c.839G>A错义突变,突变频率分别为:46.20%,5.50%,76.60%及61.40%,见表2。

图128例鼻咽部患者活检组织基因突变图

2.328例初治鼻咽癌患者不同临床特征与NGS检测BAP1、CYLD、TP53突变频率关系

BAP1在大于45岁的人群中突变频率较高,差异具有统计学意义(χ2=3.248,P=0.043)。CYLD鼻咽癌非角化性未分化型中突变频率较高,差异具有统计学差异(χ2=4.795,P=0.026),CYLD突变频率在EBVDNA拷贝数正常患者中突变频率较高,差异具有统计学意义(χ2=3.896,P=0.041)。TP53在年龄、性别、病理类型、EBVDNA拷贝数及临床分期之间均无统计学差异(P>0.05),见表3。

表128例初治鼻咽癌患者NGS检测不同病理类型基因突变结果

3、讨论

目前,以同步放化疗为主的综合治疗已成为鼻咽癌的标准治疗,靶向治疗研究靶点主要集中在表皮生长因子受体(epidermalgrowthfactorreceptor,EGFR)。虽然同步放化疗+尼妥珠单抗提高了局部晚期鼻咽癌患者的生存率,但仍有约20%鼻咽癌患者出现局部复发和远处转移[1]。迄今为止,在鼻咽癌治疗中仍缺乏针对鼻咽癌特定靶点的靶向治疗药物[2],本研究采用最新NGS技术,对鼻咽癌基因及突变位点进行深入分析,为临床鼻咽癌靶向治疗及分子机制提供可靠的实验依据。与传统测序技术相比,NGS具有同时检测多基因、多位点突变、基因拷贝数变化、肿瘤突变负荷等优点[3,4],在深入研究鼻咽癌发病机制及靶向药物治疗方面有独特优势。

对本研究纳入分析的28例初治鼻咽癌组织标本进行了288个基因的全部外显子、8个基因的内含子及启动子或融合断点区域检测,对728个基因的编码区域进行了目标区域捕获高深度测序,结果显示共检测到93个基因及115个突变功能区域,因部分基因突变频率较低未纳入统计,纳入统计的共20个突变基因,其中BAP1、CYLD及TP53突变频率较高,占总突变数的27.4%。CHUNG等[5]最新研究表明,在32例鼻咽癌样本NGS测序中,TGFBR2、CYLD及TP53突变频率较高,TGFBR2突变频率与本研究结果大致一致,BAP1突变频率存在差异可能与样本量及实验差异相关。本研究针对3个突变频率较高的基因进行突变功能区域分析,结果显示BAP1的4号外显子c.144C[2>1]移码突变,7号外显子c.496G>A错义突变,8号外显子c.587G[6>7]移码突变,13号外显子c.1471G>T无义突变及16号外显子c.1987G>A错义突变,突变频率分别为:46.70%,5.80%,13.00%,76.10%及18.20%。CYLD的7号外显子c.1103C>A无义突变,9号外显子c.1064A>G错义突变,11号外显子c.1849GT[2>1]移码突变,15号外显子c.2290A[7>6]移码突变及18号外显子c.2704C>T无义突变,突变频率分别为:40.20%,4.10%,22.10%,7.70%及33.50%。TP53的4号外显子c.272G>A无义突变,8号外显子c.916C>T无义突变,c.811G>A错义突变,c.839G>A错义突变,突变频率分别为:46.20%,5.50%,76.60%及61.40%。结果说明BAP1、CYLD及TP53突变功能区域存在显著差异,其结果可能与EBVDNA表达及鼻咽癌病理类型相关[6,7]。对比分析结果显示,BAP1在大于45岁的人群中突变频率较高,差异具有统计学意义(P=0.043)。BAP1编码的种系突变会导致BAP1肿瘤易感综合征[8,9],SEBASTIAN等[8]研究发现在间皮瘤中BAP1错义突变患者发病年龄均高于BAP1其他突变类型患者。与本研究结果一致。此外有研究表明,BAP1突变与家族易感性相关[8,10,11],此结论与鼻咽癌家族易感性一致,但目前缺乏这方面研究,仍需要更多相关研究证实这一结论。本研究发现,CYLD突变频率在EBVDNA拷贝数正常患者中突变频率较高,差异具有统计学意义(P=0.041),多项研究证实了CYLD突变失活驱动鼻咽癌肿瘤细胞生长[12,13,14,15]。LI等[16]研究发现了在鼻咽癌体细胞突变中CYLD突变频率较高,且核因子κB(NF-κB)信号通路异常和EBV癌蛋白潜伏膜蛋白1(LMP1)过表达具有肿瘤之间的互斥性。同时本研究发现在CYLD鼻咽癌非角化性未分化型中突变频率较高(P=0.026),该结果提示CYLD可能突变时间较早,临床上关注较少。NAOKI等[17]发现CYLD突变与恶性口腔癌治疗中顺铂耐药相关,由此推断在鼻咽癌患者治疗中顺铂耐药可能与CYLD突变相关,但仍需进一步研究证实。TP53基因的体细胞突变是人类最常见的突变之一[18],本研究结果发现TP53突变与鼻咽癌患者临床特征无显著相关性,一项荟萃分析观察到TP53与鼻咽癌预后显著相关[19],同时LIU等[20]发现在鼻咽鳞状细胞癌中TP53基因突变是预后不良的独立预测因素。与本研究结果相反,可能与本研究样本量较少有关。

表228例初治鼻咽癌患者NGS检测BAP1、CYLD、TP53基因位点突变结果

表328例初治鼻咽癌患者不同临床特征与NGS检测BAP1、CYLD、TP53突变频率关系

综上所述,IlluminaNextSeqCN500测序平台可作为鼻咽癌多基因突变检测手段,BAP1、CYLD及TP53在鼻咽癌中突变频率较高,对深入研究鼻咽癌发病机制及靶向药物治疗方面具有一定的指导意义,但仍需进一步大样本研究证实。

陈彦竹,何倩,马宏志,刘林,张琳,韩亚骞,刘峰.二代测序技术检测鼻咽癌相关基因突变与临床病理特征关系分析[J].现代肿瘤医学,2021,29(08):1314-1319.

基金:中国癌症基金会北京希望马拉松基金(编号:LC2016W05);湖南省自然科学基金(编号:2016JJ6088);湖南省卫生和计划生育委员会项目(编号:B2016048);长沙市科技计划项目(编号:kq1701042)