肺癌是临床常见的恶性肿瘤[1]，在诸多癌症中死亡率居于首位[2]，目前临床上总体疗效欠佳，患者生存率较低且预后大多不良，因而是亟需攻克的难题。目前，中医将“瘀毒互结”视为肺癌最重要的致病特点之一[3]。中医理论认为“百病皆瘀”“久病多瘀”“瘀阻气血”，肺癌的产生与瘀血关系密切，瘀血是导致恶性肿瘤产生的重要因素[4]。临床已证实，中医药治疗是安全有效的肺癌治疗方法之一[5]。研究表明，活血化瘀药物有相当的抗肿瘤效能[6]，此类药物对肺癌合并血液高凝状态的患者疗效好，而且安全性较高[7]。药理学研究提示，丹参具有活血化瘀、抗肿瘤的作用，其有效成分主要为脂溶性的丹参酮类和水溶性的酚酸类[8]。丹参二萜醌（diterpenoid tanshi⁃nones,DT）作为丹参酮类有效成分，在抗肿瘤和调节免疫平衡方面的作用也十分显著[9,10,11]。因此，笔者推测DT或能在中医“活血化瘀、抗癌解毒”思想指导下联合顺铂抗肿瘤，起到增强疗效的作用。

据此，本研究构建肺癌小鼠模型，通过观察小鼠体质量变化、肺组织病理变化、转移灶情况，肿瘤组织中血管内皮生长因子A(vascular endothelial growth factor A,VEGFA）、Ras基因和抑癌基因细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂1B(cyclin dependent ki⁃nase inhibitor 1B,CDKN1B）、Bcl-2关联X(Bcl-2 as⁃sociated X,Bax）蛋白表达，以及辅助性T细胞17(T helper 17 cells,Th17）相关转录因子维甲酸相关孤儿受体-γt(retinoic acid receptor-related orphan recep⁃tor-γt,ROR-γt）和调节性T细胞（regulatory T cells,Treg）相关转录因子叉头框蛋白P3(forkhead box pro⁃tein P3,Foxp3）的表达，明确DT抗肺癌的相关机制；并进一步通过比较不同剂量DT以及DT与顺铂联用抗肺癌效能的差异，验明DT对顺铂的增效作用。

1、材料和方法

1.1 材料

1.1.1 细胞株

腺癌人类肺泡基底上皮细胞A549，购于浙江中医药大学动物实验中心。

1.1.2 动物

无特定病原体（specific pathogen free,SPF）级雄性BALB/c-nu裸鼠56只，4～5周龄，购于上海斯莱克实验动物有限责任公司[实验动物生产许可证号：SCXK（沪）2022-0004]，饲养于浙江鹰旸医药研发有限公司屏障系统内[实验动物使用许可证号：SYXK（浙）2021-0003]。

1.1.3 药物与试剂

DT由浙江省中医“瘀毒”证重点实验室提供；顺铂购于碧云天生物技术有限公司（批号：15663-27-1);VEGFA抗体、Ras抗体、p27 KIP 1抗体、Bax抗体均购于美国Abcam公司（批号：GR3217142-12、GR3375645-14、GR3395252-14、GR3368232-10）；甘油醛-3-磷酸脱氢酶（glyceralde⁃hyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH）抗体购于武汉三鹰生物技术有限公司（批号：00100134);EZ-10总RNA小量提取试剂盒购于上海生工生物工程股份有限公司（批号：I829KA6099);SYBR Green核酸凝胶染液、实时荧光定量聚合酶链式反应（Real-time quantitative polymerase chain reaction,Real-time qPCR）试剂盒购于上海翌圣生物科技股份有限公司（批号：H0108041）；逆转录试剂盒购于泰州康为世纪生物科技有限公司（批号：36320）。

1.2 造模分组及干预

1.2.1 造模及分组

将8只小鼠设为空白组，不作处理；余下48只小鼠用于建模，将含有A549细胞2×107/mL的细胞悬液注射于建模小鼠腋部皮肤下，剂量为0.1 mL/只，建立小鼠移植瘤模型，并将造模成功的小鼠随机分为模型组、顺铂组（2.5 mg·kg-1）、DT低剂量组（DT-L,DT剂量为15 mg·kg-1）、DT中剂量组（DT-M,DT剂量为30mg·kg-1）、DT高剂量组（DT-H,DT剂量为60 mg·kg-1）、顺铂+DT高剂量组（顺铂2.5 mg·kg-1+DT 60 mg·kg-1），每组8只。

1.2.2 给药干预

各组成瘤后除正常喂水、给食以外，开始注射和灌胃给药，连续21 d。空白组不予任何处理；模型组予0.5%羧甲基纤维钠（carboxymeth⁃ylcellulose sodium,CMC-Na）溶液0.1 mL/10 g灌胃，1次/d，同时腹腔注射无菌0.9%氯化钠溶液0.1 mL/10 g,1次/3 d;DT各组予相应药物0.1 mL/10 g灌胃，1次/d，同时腹腔注射无菌0.9%氯化钠溶液0.1 mL/10 g,1次/3d；顺铂组给予顺铂0.1mL/10 g注射，1次/3 d，同时予0.5%CMC-Na溶液0.1 mL/10 g灌胃，1次/d；顺铂+DT高剂量组给予顺铂0.1 mL/10 g注射，1次/3d，同时给予相应剂量DT 0.1mL/10 g灌胃，1次/d。

1.3 检测指标和方法

1.3.1 一般情况

每日定时观察并记录小鼠的精神状态，进食、排便情况等，每周完成1次体质量测量，每隔3 d天测量肿瘤组织的长径和短径，计算肿瘤体积，体积（mm3）=长径×短径2/2。

1.3.2 抑瘤率

连续给药21 d后，脱颈处死小鼠，分离实体瘤组织，计算抑瘤率，抑瘤率（%）=（模型组平均瘤体质量-给药组平均瘤体质量）/模型组平均瘤体质量×100%。

1.3.3 肺组织病理

取各组小鼠肿瘤组织、肺组织标本进行苏木精-伊红（hematoxylin-eosin,HE）染色，光镜下观察各组病理学变化，包括肺癌转移灶并拍照。

1.3.4 免疫印迹法检测肿瘤组织VEGFA、Ras和CDKN1B、Bax表达

收集各组小鼠肿瘤组织，裂解，提取总蛋白，使用二喹啉甲酸（bicinchonininc acid,BCA）法进行蛋白定量。经过电泳、转膜、封闭、一抗二抗孵育后，化学发光试剂法显影定影。采用Quan⁃tity One软件分析条带强度，以GAPDH为内参，检测VEGFA、Ras和CDKN1B、Bax的表达水平。

1.3.5 Real-time qPCR检测小鼠肿瘤组织ROR-γt和Foxp3表达

提取肿瘤组织总RNA，检测纯度后，根据试剂盒说明逆转录合成cDNA，并完成qPCR反应。反应条件：变性95℃，10 min;95℃，15 s;60℃，60 s，共40次循环。以GAPDH为内参，检测ROR-γt和Foxp3基因表达水平。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。见表1。  

表1 引物序列  

1.4 统计学分析

采用SPSS 20.0统计软件进行统计学分析。计量资料以表示，若符合正态分布且满足方差齐性，多组间比较采用单因素方差分析，进一步两两比较采用Tukey检验；若符合正态分布但方差不齐，则采用Dunnett’s T3检验或独立样本t检验；若不符合正态分布，则采用Kruskal-Wallis H检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2、结果

2.1 各组小鼠一般情况比较

造模前各组小鼠的体质量、进食和排便情况无差异。给药21 d后，与空白组比较，随着瘤体生长，各组小鼠都有不同程度的进食量减少、反应迟缓、体质量下降等现象。给药21 d后，模型组体质量显著低于空白组（P<0.01）。与模型组比较，顺铂组，DT中、高剂量组和顺铂+DT高剂量组体质量不同程度升高（P<0.01,P<0.05），但均低于空白组。与顺铂组比较，顺铂+DT高剂量组体质量略微升高，但差异无统计学意义（P>0.05）。见表2。DT剂量越高，小鼠体质量有所升高，但差异无统计学意义（P>0.05）。见表2。 

表2 各组小鼠体质量变化  

2.2 各组小鼠肿瘤体积和抑瘤率比较

与模型组比较，给药6 d后，顺铂组、DT高剂量组和顺铂+DT高剂量组小鼠肿瘤体积显著降低（P<0.01,P<0.05）；给药9 d后，顺铂组，DT中、高剂量组和顺铂+DT高剂量组肿瘤体积显著降低（P<0.01,P<0.05）；给药21 d后，顺铂组，DT中、高剂量组和顺铂+DT高剂量组肿瘤体积显著降低（P<0.01）。与顺铂组比较，顺铂+DT高剂量组瘤体积进一步降低，但差异无统计学意义（P>0.05）。DT剂量越高，瘤体积越小，但差异无统计学意义（P>0.05）。见表3。

给药21 d后，与模型组比较，顺铂组，DT中、高剂量组和顺铂+DT高剂量组抑瘤率均显著升高（P<0.01）。与顺铂组比较，顺铂+DT高剂量组抑瘤率有所升高，但差异无统计学意义（P>0.05）。DT剂量越高，抑瘤率越高，但差异无统计学意义（P>0.05）。见图1。

2.3 各组小鼠肺组织病理情况

空白组肺组织基本正常，无明显损伤，无转移灶。模型组肺组织损伤严重，肺泡间壁增宽，炎性细胞浸润，出现大量转移灶。顺铂组，DT低、中、高剂量组和顺铂+DT高剂量组肺组织损伤、炎性细胞浸润均有不同程度好转，其中顺铂+DT高剂量组肺组织炎性细胞浸润好转程度好于顺铂组。DT剂量越高，肺组织炎性细胞浸润好转程度越高。见图2。 

表3 各组小鼠肿瘤体积比较 

图1 各组小鼠抑瘤率变化情况  

与空白组比较，模型组肺组织转移灶数量显著增加（P<0.01），各干预组有不同程度增加。与模型组比较，DT低剂量组转移灶数量差异无统计学意义（P>0.05），顺铂组，DT中、高剂量组和顺铂+DT高剂量组肺组织转移灶数量均显著减少（P<0.05,P<0.01）。与顺铂组比较，顺铂+DT高剂量组转移灶数量更少，但差异无统计学意义（P>0.05）。随着DT剂量升高，肺组织转移灶数有所下降，但无统计学意义（P>0.05）。见表4。 

表4 各组小鼠肺组织转移灶数 

图2 各组小鼠肺组织转移灶（HE染色）  

2.4 各组小鼠促癌基因和抑癌基因表达比较

与空白组比较，模型组肿瘤组织中VEGFA、Ras蛋白表达水平显著升高（P<0.01),CDKN1B、Bax蛋白表达水平显著下降（P<0.01）。与模型组比较，顺铂组，DT低、中、高剂量组和顺铂+DT高剂量组肿瘤组织中VEGFA、Ras蛋白表达降低（P<0.01),CDKN1B、Bax蛋白表达上调（P<0.01,P<0.05）。与顺铂组比较，顺铂+DT高剂量组作用更为明显，但差异无统计学意义（P>0.05）。DT剂量越高，VEGFA、Ras表达水平越低，CDKN1B、Bax表达水平越高，但差异无统计学意义（P>0.05）。见图3～5。

图3 各组小鼠肿瘤组织中VEGFA、Ras、CDKN1B、Bax蛋白表达条带   

图4 各组小鼠肿瘤组织中VEGFA、Ras、CDKN1B、Bax蛋白表达比较   

图5 DT各剂量组VEGFA、Ras、CDKN1B、Bax表达水平比较  

2.5 各组小鼠ROR-γt和Foxp3表达比较

与空白组比较，模型组肿瘤组织ROR-γt和Foxp3表达水平显著升高（P<0.01）。与模型组比较，顺铂组，DT低、中、高剂量组和顺铂+DT高剂量组肿瘤组织ROR-γt和Foxp3基因表达水平显著降低（P<0.01,P<0.05）。与顺铂组比较，顺铂+DT高剂量比顺铂组降低为更明显，但差异无统计学意义（P>0.05）。DT剂量越高，肿瘤组织中ROR-γt和Foxp3表达水平越低，但差异无统计学意义（P>0.05）。见图6。

图6 各组小鼠肿瘤组织ROR-γt和Foxp3 mRNA表达比较   

3、讨论

丹参是活血化瘀代表药物之一，现代研究表明丹参对肺癌的治疗有重要意义，具备“除寒热积聚、破癥除瘕”之能，针对肺癌之“瘀毒”，有很好的活血化瘀解毒和消聚散积作用。本课题组前期研究发现，DT作为天然丹参中提取的重要脂溶性化合物，富含丹参酮ⅡA、丹参酮Ⅰ、隐丹参酮、二氢丹参酮Ⅰ等有效成分，具有较为可靠的抗肿瘤效能，因此尤其适合“瘀毒互结”型肺癌的治疗。

VEGFA能够促进肿瘤血管生成，而癌基因Ras对细胞生长和分化有调控作用，参与了多种肿瘤的形成与发展，因此VEGFA、Ras都是重要的致癌基因，致癌基因表达水平和肿瘤生成呈正相关。CDKN1B即p27基因，是一种能够抑制肿瘤细胞增殖的基因，而Bax基因是人体最主要的促凋亡基因，可通过过表达促进肿瘤细胞凋亡，因此CDKN1B、Bax都是重要的抑癌基因，抑癌基因表达水平和肿瘤生成呈负相关。本研究发现，与空白组比较，模型组肿瘤组织中促癌基因VEGFA、Ras蛋白表达水平显著升高，抗癌基因CDKN1B、Bax蛋白表达水平显著降低；与模型组比较，顺铂组，DT低、中、高剂量组和顺铂+DT高剂量组肿瘤组织中VEGFA、Ras蛋白表达显著降低，CDKN1B、Bax蛋白表达显著升高。而DT剂量越高，致癌基因的表达水平越低，抑癌基因的表达水平越高，但差异无统计学意义。据此可以得出结论，DT在基因水平上发挥了抗肺癌作用，且此作用可能具有剂量依赖性。

对Treg和Th17细胞进行有效的调节，是逆转肿瘤转移过程中的炎性内环境的关键，同时也是逆转肿瘤转移过程中炎性内环境免疫逃逸的重要机制[12]。肠道具有复杂的微生态系统，发挥着众多功能。肠道不仅是消化器官，也是免疫器官，人体内七成以上的免疫细胞都存在于肠道内。Treg细胞是一种广泛存在的免疫调节细胞，而Th17是特异性存在并组成性表达于肠道固有层的免疫细胞[13]，二者对于肠道免疫环境的稳定都至关重要。在肿瘤的发展过程中，Treg细胞可以调节免疫应答强度[14]，所以能够抑制效应性T细胞的特异性杀伤作用，因而Treg细胞能够诱导肿瘤细胞产生免疫耐受，使肿瘤细胞不容易被效应性T细胞杀伤，最终导致肿瘤的进展和转移。Th17可诱导白介素-6(interleukin-6,IL-6）的产生，而IL-6又可以激活信号传导和转录激活因子3(signal trans⁃ducer and activator of transcription 3,STAT3）通路，导致肿瘤血管形成基因上调，最终引发肿瘤转移[12]。Foxp3是Treg细胞免疫调节特异性表达的分子，同时对Treg细胞的发育和功能至关重要[15]，故Foxp3目前被公认为Treg细胞的敏感特异性标志[12]。RORγt是Th17细胞的特异性转录因子，能够特异性调节Th17细胞的功能。综上所述，通过观察Treg细胞特异性敏感因子Foxp3以及Th17细胞特异性敏感因子ROR-γt的表达变化，可以分析出DT对肺癌中肠道相关免疫机制的影响。Wu等[16]研究发现，非小细胞肺癌患者外周血中转录因子Foxp3以及ROR-γt表达升高。本研究结果提示，与空白组比较，模型组肿瘤组织ROR-γt和Foxp3的表达水平显著升高；与模型组比较，顺铂组、DT各剂量组和顺铂+DT高剂量组肿瘤组织ROR-γt和Foxp3的mRNA表达水平显著降低；DT三个剂量组间比较，DT剂量越高，ROR-γt和Foxp3的表达水平越低。说明DT可以抑制ROR-γt和Foxp3表达，进一步表明Th17和Treg细胞增殖受到了抑制，那么在一定程度上可以认为DT能够抑制Th17细胞诱导的肿瘤血管生成以及Treg诱导的免疫耐受，最终达到抑制肿瘤转移的目的。

进一步比较表明，与顺铂组比较，顺铂+DT高剂量组在体质量、炎性细胞浸润的好转程度、转移灶计数、瘤体积大小、抑瘤率，致癌基因和抑癌基因的调控，以及ROR-γt以及Foxp3表达方面具有一定优势。由此推测，口服DT对顺铂抗肺癌可能起到了一定的增效作用。

综上所述，DT可能通过调节促癌（致癌）基因和抑癌基因的表达在基因层面上发挥抗癌作用，同时也可以通过降低ROR-γt和Foxp3的表达水平，说明其能在一定程度上抑制Th17和Treg细胞增殖，以维持肠道免疫平衡，改善人体的免疫功能，进而起到抑制肿瘤免疫耐受和侵袭、转移的作用，DT与顺铂的联合用药结果说明了DT还可以增强顺铂抗肺癌的疗效。本研究立足中医“瘀毒”理论及课题组前期试验，创新性探讨了DT抗肺癌的相关机制以及DT与顺铂联合用药时DT对顺铂的“增效”趋势，为进一步发掘中医药防治肺癌的潜能提供了新的思路和实验依据。

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基金资助:浙江省重点研发计划中药创新药物研究项目(2019C03072)~~;

文章来源:秦逸杨,徐晓楠,张光霁.丹参二萜醌对顺铂的增效作用及抗肺癌相关机制研究[J].浙江中医药大学学报,2024,48(04):379-387.