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UCA1-miR-582-EZH2轴对肺癌细胞A549生物学功能的影响机制

2024-04-26 13 上传者：管理员

摘要：目的探究尿路上皮癌相关1基因(UCA1)调控miR-582-5p-Zeste增强子同源物(EZH)2信号轴在非小细胞肺癌(NSCLC)中的调控机制。方法逆转录-聚合酶链式反应(qRT-PCR)检测UCA1、miR-582-5p和EZH2在NSCLC组织及细胞系(NCI-H460、A549和NCI-H1299)中的表达；Western印迹检测EZH2在NSCLC组织中的蛋白表达；原位杂交(FISH)检测UCA1和miR-582-5p的信号强度；双荧光素酶报告基因检验miR-582-5p抑制剂靶向UCA1和EZH2的调控机制；qRT-PCR检测下调UCA1/miR-582-5p对EZH2 mRNA的调控关系；Transwell、TUNEL细胞凋亡和CCK8分别检测下调UCA1-miR-582-5p-EZH2轴对侵袭、凋亡和增殖的调控能力。结果 UCA1和EZH2在NSCLC组织和细胞系中高表达，miR-582-5p则相反为低表达。UCA1竞争性结合miR-582-5p,且miR-582-5p抑制剂可以回补siUCA1负调控EZH2。siUCA1-In-miR-582-5p-siEZH2轴能抑制A549细胞增殖、侵袭及促进凋亡。结论干扰UCA1-miR-582-5p-EZH2轴可能抵抗NSCLC的发生发展。

关键词：
A549
miR-582-5p
Zeste增强子同源物(EZH)2
尿路上皮癌相关1基因(UCA1)
非小细胞肺癌(NSCLC)
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肺癌一直以来都是发病率和死亡率极高的癌症[1],其中以非小细胞肺癌(NSCLC)为主[2]。随着癌症精准治疗开展[3]及放、化疗手段提高，NSCLC治疗取得了一定进展，但现阶段相较其他癌症，肺癌仍具有高转移率及易侵袭的特点，因此，寻找具有指导意义的NSCLC调控因子是提高肺癌治疗水平的关键。长链非编码RNA(lncRNA)被发现参与调控NSCLC进程[4],尿路上皮癌相关1基因(UCA1)是一种新型的功能性lncRNA,在宫颈癌[5]、膀胱癌[6]、结肠癌[7]中被发现异常高表达，有作为肿瘤治疗干预靶点的潜力。然而UCA1-miR-582-5p-Zeste增强子同源物(EZH)2轴的调控网络在NSCLC中作用未见报道。本文主要研究UCA1-miR-582-5p-EZH2轴对肺癌细胞A549生物学功能的影响机制。

1、材料与方法

1.1 研究样本采集

组织样本采集自定州市人民医院经病理确诊的54例NSCLC手术患者切除的肿瘤及癌旁正常组织，平均年龄(50.49±13.81)岁，样本均得到定州市人民医院伦理委员会批准。

1.2 NSCLC细胞培养和转染

人正常肺上皮细胞BEAS-2B及肺癌细胞NCI-H460、A549和NCI-H1299。培养液：RPMI1640添加10%胎牛血清，抗生素100 U/ml青霉素和100 μg/ml链霉素。培养条件：37 ℃,5%CO2。功能性实验选用A549细胞，按照转染试剂LipofectamineTM3000 说明书将A549细胞分为In-NC组、siUCA1 组、siEZH2组、In-miR-582-5p 组、In-miR-582-5p+siEZH2 组、siEZH2+In-miR-582-5p+siUCA1 组，分别转染阴性对照、UCA1干扰表达载体、EZH2干扰表达载体miR-582-5p抑制剂、共转染miR-582-5p抑制剂和EZH2干扰表达载体及共转染UCA1干扰表达载体、miR-582-5p抑制剂和EZH2干扰表达载体。

1.3 逆转录-聚合酶链式反应(qRT-PCR)检测NSCLC组织或细胞系中mRNA表达

使用Trizol从肺癌细胞系或定州市人民医院收集的NSCLC组织样本提取总RNA,采用逆转录试剂盒将提取的总RNA合成cDNA,进行实验。实验结果以2-ΔΔCt值形式得到。EZH2正向引物：5′-AATCAGAGTACATGCGACTGAGA-3′,反向：5′-GCTGTATCCTTCGCTGTTTCC-3′;GAPDH正向引物：5′-TGTGGGCATCAATGGATTTGG-3′;反向：5′-ACACCATGTATTCCGGGTCAAT-3′。

1.4 双荧光素酶报告基因实验

构建UCA1或EZH2的野生型(WT)和突变(MUT)质粒。分别提取UCA1-WT、EZH2-WT、UCA1-MUT、EZH2-MUT的质粒，与miR-582-5p inhibitor共同转染A549细胞，上机检测荧光素酶的活性。

1.5 原位杂交(FISH)检测NSCLC组织中UCA1、miR-582-5p表达

将收集的NSCLC组织连续切片，置于4 ℃保存。切片制作过程中应尽量避免RNA酶污染。采用荧光显微镜观察拍照。

1.6 Western印迹检测NSCLC组织中EZH2蛋白表达

从NSCLC组织中提取总蛋白，检测蛋白浓度，等量(40 μg)提取的蛋白用10%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离，然后将蛋白转到聚偏氟乙烯(PVDF)膜上，5%脱脂奶粉37 ℃封闭1 h。将PVDF膜室温封闭1 h后分别加入EZH2(1∶500)及兔抗GAPDH抗体(1∶1 000)的抗体稀释液中4 ℃过夜，TBST洗3次，每次10 min, 辣根过氧化物酶(HRP)标记山羊抗兔的二抗中室温孵育1 h, 用化学发光法检测蛋白表达水平。所得蛋白条带图片，使用软件对图像进行分析，以GAPDH的光密度值作为内参来校正自目的蛋白的光密度值。

1.7 CCK8实验检测UCA1-miR-582-5p-EZH2轴对A549细胞增殖能力的影响

A549细胞按1×104个/孔接种于96孔板，每孔200 μl细胞悬液，常规培养24 h后，参照CCK-8试剂盒操作说明书操作向每孔加入10 μl CCK-8溶液，37 ℃孵育 1～2 h后，用酶标仪测定450 nm处的吸光度(OD)值。

1.8 Transwell侵袭检测UCA1-miR-582-5p-EZH2轴对A549细胞侵袭能力影响

基质胶对Transwell 小室进行预包被，各组A549细胞细以密度为1×106接种于上室，24 h后，将小室用95%乙醇中固定10 min, 结晶紫染色液染色，24 h后轻拭去上层细胞，显微镜下观察下层细胞侵袭数量。

1.9 TUNEL实验检测UCA1-miR-582-5p-EZH2轴对A549细胞凋亡能力的影响

在4%多聚甲醛中固定30～60 min, 在0.3%H2O2中室温孵育20 min。加50 μl生物素标记液，37 ℃孵育60 min。滴加0.1～0.3 ml标记反应终止液，室温孵育10 min, 加50 μl辣根过氧化物酶标记链霉亲和素(Streptavidin-HRP)工作液，室温孵育30 min。滴加0.2～0.5 ml二氨基联苯胺(DAB)显色液，室温孵育5～30 min或根据显色情况孵育适当时间。用苏木素染色液进行细胞核染色。用95%乙醇脱水5 min, 再用100%乙醇脱水2次，每次约3 min, 再用甲苯透明2次，每次5 min, 随后封片观察。

1.10 统计学方法

采用SPSS22.0软件进行t检验、One-way ANOVA分析。

2、结果

2.1 UCA1、miR-582-5p及EZH2 在NSCLC组织中表达

与癌旁组织相比，UCA1和EZH2 mRNA相对表达在NSCLC组织显著升高，而miR-582-5p mRNA相对表达显著降低(P<0.05),见表1。UCA1在肺癌组织中信号强度高于癌旁组织，而miR-582-5p则降低，NSCLC组织中EZH2蛋白表达升高，见图1、图2。

表1 NSCLC组织中 UCA1、miR-582-5p及EZH2 mRNA的表达

图1 FISH检测两组UCA1、miR-582-5p阳性表达(×500)

图2 Western印迹检测NSCLC组织中EZH2蛋白表达

2.2 UCA1、miR-582-5p及EZH2 在NSCLC细胞系中表达

相比人正常肺上皮细胞(BEAS-2B),UCA1和EZH2在NCI-H460(t=18.831、17.978)、A549(t=20.938、25.208)和NCI-H1299细胞(t=19.946、17.054)中的表达显著增加(均P<0.001),而miR-582-5p, 均呈现显著低表达(t=9.998、21.053、5.567,均P<0.001)。其中A549细胞变化最明显，将用于后续细胞实验，见表2。

表2 NSCLC细胞中 UCA1、miR-582-5p及EZH2的表达

2.2 UCA1竞争性结合 miR-597-5p靶向调控EZH2表达

生物信息学软件发现miR-582-5p能够与UCA1或EZH2结合，见图3。与In-NC组相比，In-miR-582-5p组能够显著升高UCA1-WT及EZH2-WT的荧光素酶的活性(P<0.05),而UCA1-MUT及EZH2-MUT荧光素酶无明显变化(P>0.05),见表3。

图3 生物信息学分析预测miR-18a-5与UCA1结合位点

2.3 下调UCA1-miR-582-5p-EZH2轴调控A549细胞的增殖、侵袭及凋亡

相比In-NC组，siEZH2组和siUCA1组A549细胞增殖(OD值)及侵袭细胞数显著降低，而In-miR-582-5p组A549细胞OD值及侵袭细胞数显著增高(P<0.05);但相比In-miR-582-5p组，siEZH2+In-miR-582-5p组A549细胞OD值及侵袭细胞数显著降低(P<0.05),相比siEZH2+In-miR-582-5p组，siEZH2+In-miR-582-5p+siUCA1组A549细胞OD值及侵袭细胞数显著降低(P<0.05)。相比In-NC组，siEZH2组和siUCA1组A549细胞凋亡率显著升高，In-miR-582-5p组凋亡率显著降低(P<0.05),相比In-miR-582-5p组，siEZH2+In-miR-582-5p组细胞凋亡率显著升高(P<0.05),相比siEZH2+In-miR-582-5p组，siEZH2+In-miR-582-5p+siUCA1组A549细胞凋亡率显著升高(P<0.05)。见表4、图4。

表3 双荧光素酶报告实验

表4 下调UCA1-miR-582-5p-EZH2轴对A549细胞的增殖、侵袭及凋亡影响

图4 下调UCA1-miR-582-5p-EZH2轴对A549细胞侵袭(结晶紫染色，×500)、凋亡(TUNEL染色，×500)影响

3、讨论

lncRNA与NSCLC的发病机制存在密切联系，并已证实多种lncRNAs可作为NSCLC的预测因子[8,9]。在NSCLC中，Chen等[10]发现，lncRNA人卵巢癌特异性转录本(HOST)2通过下调miR-621增强NSCLC的吉非替尼耐药；Xu等[11]发现，沉默lncRNA X染色体失活特异转录子(XIST)表达可抑制NSCLC的生长，多种lncRNA已证实与NSCLC发生发展进程相关，UCA1于2006年首次在人类膀胱癌中发现，研究发现，UCA1在多种癌症中表达上调，认为UCA1 的表达水平与多种恶性肿瘤患者的预后呈正相关[12,13],本研究说明，UCA1的异常表达可能与NSCLC息息相关。

lncRNA作为竞争性内源RNA(ceRNA)在癌症中发挥重要调控作用[14,15]。EZH2是一种转录因子，研究证实EZH2在各种肿瘤肺癌在内的多种癌症中过度表达。Chen等[16]研究发现，在肺癌细胞中EZH2异常高表达，并可以促进肺癌细胞增殖，本研究发现，EZH2在NSCLC组织和细胞系中也均呈现高表达。

在肿瘤发展进程中，lncRNA表达失调不仅体现在组织或细胞差异表达，同时体现在细胞外体液水平。本研究发现，miR-582-5p对NSCLC调控机制和UCA1完全相反，体外、体内实验中miR-582-5p在NSCLC组织和细胞系中均呈现低表达，下调miR-582-5p促进A549细胞侵袭、增殖及抑制凋亡，促进皮下肿瘤生长和细胞增殖；根据ceRNA调控机制的理论，对下调UCA1-miR-582-5p-EZH2轴的调控机制进行检测发现，miR-582-5p抑制剂可逆转siUCA1负调控EZH2 mRNA的表达。发现siEZH2能补救In-miR-582-5p的促进增殖、侵袭、迁移及抑制细胞凋亡作用，而共转染siUCA1+In-miR-582-5p+siEZH2进一步挽救了In-miR-582-5p的促癌作用。

综上所述，UCA1与miR-582-5p结合，减弱miR-582-5p对EZH2 mRNA的翻译水平，而干扰UCA1-miR-582-5p-EZH2轴可能抗NSCLC的发生发展。UCA1可能成为NSCLC诊断及治疗的新靶点。

基金资助:河北省医学科学研究课题计划(20220433);

文章来源:赵蒙,陈志辉,屈鑫,等.UCA1-miR-582-EZH2轴对肺癌细胞A549生物学功能的影响机制[J].中国老年学杂志,2024,44(08):1922-1925.