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非小细胞肺癌中miR-224靶向抑制ECRG4表达对其细胞增殖、迁移和侵袭的影响

  2020-09-11    195  上传者:管理员

摘要:目的:研究微小RNA-224(miR-224)及其靶基因食管癌相关基因4(ECRG4)在非小细胞肺癌(NSCLC)中的表达和对A549细胞增殖、迁移、侵袭的影响。方法:利用原位杂交、荧光定量PCR、免疫组织化学和Westernblot检测NSCLC临床标本和细胞系中miR-224和ECRG4的表达水平;通过microRNA.org网站预测miR-224与ECRG4的靶向关系,并行双荧光素酶报告基因实验和Westernblot进行验证;分析抑制miR-224及联合抑制ECRG4对A549细胞增殖、迁移和侵袭能力的影响。结果:NSCLC癌组织中miR-224表达水平明显高于癌旁组织,ECRG4mRNA和ECRG4蛋白表达水平均明显低于癌旁组织,差异有统计学意义(P<0.05)。与健康人肺支气管上皮细胞系HBE相比,NSCLC细胞系L78、A549、H460中miR-224表达水平明显升高,ECRG4mRNA和ECRG4蛋白表达水平明显降低,差异有统计学意义(P<0.05)。经microRNA.org网站预测、双荧光素酶报告基因实验和Westernblot证实,ECRG4是miR-224的靶基因。抑制miR-224可抑制A549细胞增殖、迁移和侵袭(P<0.05),而联合抑制ECRG4则可逆转抑制miR-224对A549细胞的抑制作用(P<0.05)。结论:miR-224可通过靶向ECRG4促进NSCLC细胞A549增殖、迁移和侵袭,提示miR-224和ECRG4可能成为诊断和治疗NSCLC的靶点。

  • 关键词:
  • 增殖
  • 微小RNA-224
  • 迁移
  • 非小细胞肺癌
  • 食管癌相关基因4
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非小细胞肺癌(NSCLC)占所有肺癌的80%[1]。微小RNA(miRNA)是一类非蛋白编码RNA,可通过负调节信使RNA的稳定性或抑制其翻译来实现转录后对基因的表达调控[2]。研究表明,miRNA在细胞的生长、凋亡、分化和发育过程中起重要的作用[3]。此外,miRNA的表达谱被证实在肝癌、肺癌等多种肿瘤中具有原癌基因或抑癌基因的功能[2]。据报道,miR-224在乳腺癌、胆管癌和NSCLC中高表达[4,5,6]。然而,miR-224在NSCLC中的作用和分子机制仍未完全阐明。食管癌相关基因4(ECRG4)位于染色体2q12.2处,最初被认为是食管癌中的抑癌基因[7]。有研究表明,ECRG4在其他多种肿瘤中也是候选的抑癌基因[8]。最近研究表明,自噬基因Beclin-1可通过上调ECRG4通路,抑制A549肺癌细胞增殖,并促进其凋亡[9,10]。然而,ECRG4在NSCLC中的作用机制仍不明确。本研究通过探讨miR-224、ECRG4在NSCLC中的表达,以及miR-224靶向ECRG4对NSCLC细胞A549增殖、迁移和侵袭的影响,来进一步揭示NSCLC发生、发展的分子机制,以期为临床诊断治疗提供新的思路。


1、资料与方法


1.1 一般资料

收集2016年1月至2018年12月于青海省心脑血管病专科医院行手术切除治疗的NSCLC患者癌组织和癌旁组织标本共68例,其中男39例,女29例;年龄37~75岁,平均(48.5±11.2)岁;高分化28例,中低分化40例;TNM分期Ⅰ~Ⅱ期25例,Ⅲ~Ⅳ例43例。所有患者均经病理诊断证实为NSCLC,且术前未接受任何放疗或化疗。本研究经青海省心脑血管病专科医院伦理委员会审核批准,所有研究对象或其家属均签署知情同意书。

1.2 仪器与试剂

Lipofectmine2000转染试剂(批号:11668019)购自美国Invitrogen公司;RNAisoplus(批号:9108)、PrimeScriptTMRTreagentKitwithgDNAEraser(批号:RR047A)、SYBR?PremixExTaqTM(批号:DRR081A)、TakaRa点突变试剂盒(批号:R401)均购自大连TaKaRa公司;放射免疫沉淀法(RIPA)裂解液(批号:C1053)、二喹啉甲酸(BCA)蛋白定量试剂盒(批号:P0009)均购自上海碧云天生物技术有限公司;DualLuciferase?ReporterAssaySystem试剂盒(批号:E1960)购自美国Promega公司;anti-miR-NC、anti-miR-224、si-NC和si-ECRG4均购自广州锐博生物技术有限公司;ECRG4(批号:ab224077)、GAPDH(批号:ab181602)抗体均购自美国abcam公司;5′和3′-双地高辛标记的MIRURYLNAmicroRNADetectionProbe试剂盒(批号:10000-89999-15)购自EXIQON公司。健康人肺支气管上皮细胞系HBE和NSCLC细胞系H460、A549、L78购自中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库,于实验室的液氮罐中保存备用。

1.3 方法

1.3.1 细胞培养与转染

HBE、L78用含10%胎牛血清的DMEM培养基培养,A549用含10%胎牛血清的F-12k培养基培养,H460用含10%胎牛血清的RPMI1640培养基培养,并置于37℃、含5%CO2的细胞培养箱中。用Lipofectmine2000分别将miR-NC、miR-224、anti-miR-NC、anti-miR-224、anti-miR-224联合si-NC及anti-miR-224联合si-ECRG4转入A549细胞中,分别记为miR-NC组、miR-224组、anti-miR-NC组、anti-miR-224组、anti-miR-224+si-NC组和anti-miR-224+si-ECRG4组,培养48h后,提取RNA和蛋白进行后续研究。

1.3.2 荧光定量PCR检测

根据RNAisoplus说明书提取NSCLC癌组织、癌旁组织标本和细胞系总RNA,采用PrimeScriptTMRTreagentKitwithgD-NAEraser试剂盒进行反转录,SYBR?PremixExTaqTM试剂盒检测上述标本中miR-224和ECRG4的表达水平,分别以U6和β-actin作为内参。miR-224正向引物为5′-GAGCCAAGTCACTAGTGGT-3′,反向引物为5′-GTGCAGGGTCCGAGGT-3′;U6正向引物为5′-TGCGGGTGCTCGCTTCGGCAGC-3′,反向引物为5′-CCAGTGCAGGGTCCGAGGT-3′;ECRG4正向引物为5′-CCGGTTCTCCCTCGCAG-CAC-3′,反向引物为5′-CGCTTCTGGCGCTTCAG-GCT-3′;β-actin正向引物为5′-GAACCCCAAGGC-CAACCGCGAGA-3′,反向引物为5′-TGACCCCGT-CACCGGAGTCCATC-3′。每个细胞系设置3个复孔,重复检测3次。

1.3.3 Westernblot检测

用RIPA裂解液提取NSCLC癌组织、癌旁组织标本和细胞系总蛋白,采用BCA蛋白定量试剂盒检测蛋白水平。采用SDS-PAGE电泳分离蛋白标本,并转至PVDF膜上,5%脱脂牛奶封闭2h,加入ECRG4和GAPDH抗体,置于摇床上4℃孵育过夜,然后用辣根过氧化物酶偶联二抗室温孵育2h,ECL发光液孵育条带并置于化学发光成像系统中进行曝光显影,ImageJ软件分析相应蛋白的相对表达水平。每个细胞系设置3个复孔,重复检测3次。

1.3.4 原位杂交和免疫组织化学检测

采用5′和3′-双地高辛标记的MIRURYLNAmicroRNADetectionProbe试剂盒进行原位杂交分析。采用VEN-TANABenchMarkXT染色系统对切片中的ECRG4蛋白进行孵育显色。

1.3.5 双荧光素酶报告基因实验

采用PCR扩增ECRG4的3′UTR,并将其克隆至pmirGLO报告质粒中构建pmirGLO-ECRG4-Wt重组质粒。采用TakaRa点突变试剂盒将pmirGLO-ECRG4-Wt中miR-224的结合位点进行突变,构建pmirGLO-ECRG4-Mut重组质粒。采用Lipofectmine2000将miR-NC或miR-224分别与pmirGLO-ECRG4-Wt和pmirGLO-ECRG4-Mut共转至A549细胞中,48h后用DualLuciferase?ReporterAssaySystem试剂盒检测各转染细胞荧光素酶活性。

1.3.6 细胞增殖检测

取对数生长期的各组细胞各3000个接种于96孔板中,每组设置3个复孔,分别于24、48、72h时每孔加入20μL的5mg/mL噻唑蓝溶液,孵育4h后弃去废液,每孔加入150μL二甲基亚砜,然后用酶标仪震荡10min以溶解结晶,检测490nm处各孔吸光度值。

1.3.7 细胞迁移、侵袭检测

Transwell小室分为两种,1种有预铺基质胶用于检测细胞侵袭,1种无预铺基质胶用于检测细胞迁移。取对数生长期的各组细胞,每组各取200μL含1×105个细胞的细胞悬液加入Transwell小室上室中,下室中加入600μL完全培养液,每组设置3个复孔。培养48h后,经0.1%结晶紫染色后显微镜下观察并拍照,计数各组迁移、侵袭细胞数。

1.4 统计学处理

采用SPSS21.0软件进行数据分析。符合正态分布的计量资料以表示,两组间比较采用t检验,多组间比较采用单因素方差分析,多组间两两比较采用LSD-t检验。以P<0.05为差异有统计学意义。


2、结果


2.1 NSCLC癌组织及癌旁组织中miR-224和ECRG4的表达水平比较

与癌旁组织相比,癌组织中miR-224表达水平明显升高,差异有统计学意义(P<0.05),见图1A、表1。癌组织中ECRG4mRNA和ECRG4蛋白表达水平明显低于癌旁组织,差异有统计学意义(P<0.05),图1A、1B、表1。

图1NSCLC癌组织及癌旁组织中miR-224和ECRG4的表达情况

表1NSCLC癌组织和癌旁组织中miR-224和ECRG4的表达水平比较

2.2 miR-224和ECRG4在各细胞系中的表达水平比较

与健康人肺支气管上皮细胞系HBE相比,NSCLC细胞系L78、A549、H460中miR-224表达水平明显升高,ECRG4mRNA和ECRG4蛋白表达水平明显降低,差异有统计学意义(P<0.05),见图2、表2。

图2Westernblot检测细胞系HBE、L78、A549、H460中ECRG4蛋白

表2细胞系HBE、L78、A549、H460中miR-224和ECRG4的表达水平比较

2.3 ECRG4是miR-224的靶基因

利用microR-NA.org网站预测发现,ECRG4可能是miR-224的潜在靶基因,见图3。与miR-NC组A549细胞中miR-224的表达水平(1.00±0.08)比较,miR-224组A549细胞中miR-224的表达水平(4.15±0.46)明显升高,差异有统计学意义(t=11.69,P<0.05)。miR-224和pmirGLO-ECRG4-Wt共同转染的A549细胞中ECRG4-Wt荧光素酶活性(0.42±0.05)低于miR-NC和pmirGLO-ECRG4-Wt共同转染的A549细胞(1.00±0.11),差异有统计学意义(t=8.31,P<0.05);而miR-224和pmirGLO-ECRG4-Mut共同转染的A549细胞中ECRG4-Mut荧光素酶活性(1.03±0.09)与miR-NC和和pmirGLO-ECRG4-Mut共同转染的A549细胞(0.96±0.10)比较,差异无统计学意义(t=0.90,P>0.05)。

2.4 抑制miR-224可上调A549细胞中ECRG4蛋白表达

与anti-miR-NC组A549细胞中ECRG4蛋白表达水平(0.35±0.04)比较,anti-miR-224组A549细胞中ECRG4蛋白表达水平(0.96±0.09)明显增加,差异有统计学意义(t=10.73,P<0.05)。antimiR-224+si-ECRG4组A549细胞中ECRG4蛋白表达水平(0.13±0.01)明显低于anti-miR-224+si-NC组(0.94±0.09),差异有统计学意义(t=15.49,P<0.05),见图4。

图3预测的miR-224与ECRG43′UTR结合位点

图4抑制miR-224及联合抑制ECRG4后A549细胞中ECRG4蛋白表达情况

2.5 抑制miR-224对A549细胞增殖的影响

48h和72h时anti-miR-224组A549细胞吸光度值明显低于anti-miR-NC组,差异有统计学意义(P<0.05);48h和72h时anti-miR-224+si-ECRG4组A549细胞吸光度值明显高于anti-miR-224+si-NC组,差异有统计学意义(P<0.05),见表3。

2.6 抑制miR-224对A549细胞迁移、侵袭的影响

anti-miR-224组迁移、侵袭细胞数均明显低于antimiR-NC组,差异有统计学意义(P<0.05);anti-miR-224+si-ECRG4组迁移、侵袭细胞数均明显高于antimiR-224+si-NC组,差异有统计学意义(P<0.05),见表4。

表3抑制miR-224及联合抑制ECRG4后A549细胞的吸光度值比较

表4抑制miR-224及联合抑制ECRG4后A549细胞迁移和侵袭细胞数


3、讨论


肺癌是全球肿瘤相关死亡的主要原因[11]。尽管近年来在手术和药物治疗方面取得了进展,但NSCLC患者的5年生存率仍然很低,其发病机制未完全阐明[12]。因此,深入研究NSCLC进展的分子机制将有助于发现潜在的治疗靶标并优化现有的治疗方法。

近年来,越来越多的研究集中于miRNA在肿瘤中的异常表达。相关研究表明,miRNA在大多数恶性肿瘤的发病机制中起重要作用,部分miRNA在肿瘤中作为原癌基因或抑癌基因发挥作用,并参与调控多种生物过程[13]。干扰miRNA的功能被认为是肿瘤治疗的新策略。在NSCLC中,miR-326可通过靶向细胞周期蛋白D1抑制肿瘤进展,miR-22可通过靶向ATP柠檬酸裂解酶抑制骨肉瘤、前列腺癌、宫颈癌和肺癌的生长和转移[14,15]。有研究发现,miR-224可通过靶向抑制SMAD4和人肿瘤坏死因子α诱导蛋白1促进NSCLC细胞生长和侵袭[11,16]。此外,miR-224在结直肠癌、肝细胞癌和肾癌等多种肿瘤类型中表达上调[17,18,19]。上述研究均表明,miR-224是一个促癌miRNA。本研究发现,miR-224在NSCLC癌组织和细胞中高表达,抑制其表达可抑制NSCLC细胞增殖、迁移和侵袭,与CUI等[11]和ZHU等[16]的研究结果一致。

ECRG4是NF-κB等主要生长因子信号通路的调节因子,可参与调控细胞周期进程、细胞迁移、衰老、祖细胞存活、分化及炎症等[8]。大量研究发现,ECRG4在包括乳腺癌在内的多种肿瘤中表达下调或缺失[8,20]。有研究表明,低水平的ECRG4mRNA可能与乳腺癌无病生存和远处转移的发生密切相关[21]。1项Meta分析表明,ECRG4mRNA表达水平是乳腺癌无病生存率和总生存率的影响因素[22]。此外,在鼻咽癌中,ECRG4通常因启动子过度甲基化而低表达,并且恢复其表达后可通过诱导自噬增强顺铂介导的细胞死亡[8]。上述研究表明,ECRG4可能作为一个抑癌基因在多种肿瘤中发挥作用。本研究发现,在NSCLC癌组织和细胞中ECRG4低表达,ECRG4是miR-224的靶基因,联合抑制ECRG4可明显逆转抑制miR-224对NSCLC细胞A549细胞增殖、迁移和侵袭的抑制作用。


4、结论


本研究证实,在NSCLC组织和细胞中miR-224高表达,ECRG4低表达,miR-224可通过靶向ECRG4来促进NSCLCA549细胞增殖、迁移和侵袭,进一步揭示了NSCLC发病的分子机制,可能为NSCLC的诊断和治疗提供新的靶点。


参考文献:

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