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基于生物信息学分析筛选宫颈癌相关的分子标志物

2025-04-10 5 上传者：管理员

摘要：目的通过生物信息学和实验验证宫颈癌(CC)发生发展的核心基因，探索潜在的分子标志物。方法从基因表达数据库(GEO)下载基因芯片数据集[基因集富集(GSE)9750、GSE127265和GSE173097],经过筛选后得到差异表达基因(DEGs),通过基因本体论(GO)和京都基因和基因组百科全书(KEGG)通路富集分析及蛋白质相互作用(PPI)网络构建确定核心基因。随后，用手术方式收集CC患者的肿瘤组织和癌旁组织，实时荧光定量-聚合酶链反应(qRT-PCR)及Western印迹验证核心基因mRNA及蛋白表达。结果筛选出106个DEGs,其中3个基因，包括周期素依赖性蛋白激酶抑制物(CDK)1、拓扑异构酶Ⅱα(TOP2A)和Aurora激酶(AURK)B被确定为核心基因。经样本组织和细胞样本验证，发现与正常组织相比，CC组织中CDK1、TOP2A和AURKB mRNA及蛋白表达明显上调(P<0.05)。结论 CDK1、TOP2A和AURKB可能在CC发生和预后中发挥重要作用，可以进一步探索和验证其作为CC的潜在预测因子和治疗靶点。

关键词：
分子标志物
宫颈癌
差异表达基因
核心基因
生物信息学
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宫颈癌(CC)是目前全球女性中第4大最常见的恶性肿瘤〔1〕｡据统计,2018年全球有57万CC病例,而死亡病例已超过31万〔2〕｡CC发生的主要因素是高危人乳头瘤病毒(HPV)感染,HPV的预防疫苗主要有二价､四价和九价〔3〕,尽管疫苗的使用提高了患者的生存率,但是也存在死亡率｡目前,CC的治疗主要是手术和放射治疗,辅以化疗〔2,4〕｡虽然早期CC的治疗可以达到临床治愈标准,但晚期CC患者的预后和生存率很差｡因此,筛查和确定与CC进展有关的核心基因,对于早期诊断CC､提高CC患者的生存率和预后具有重要意义｡随着高通量测序技术的快速发展和推广,生物信息学为研究肿瘤的发生和发展机制提供了更丰富的平台和数据基础｡同时,研究数万个基因的表达与癌症发生之间的关系,以便于寻找致癌的关键基因,并确定癌症诊断或预后的生物标志物〔5,6〕｡因此,本研究从基因表达数据库(GEO)中获得的CC患者mRNA表达数据,通过基因的差异表达分析,得到差异表达基因(DEGs),对其进行功能注释和信号通路分析,以进一步了解它们在CC发生中的功能｡此外,对CC的病理组织和细胞进行实验对比,使得DEGs水平和预后价值得到了验证｡

1、材料与方法

1.1选择基因芯片CC患者基因表达数据从GEO下载｡在GEO数据库中,获得了CC的基因数据集｡基因集富集(GSE)9750是基于GPL570平台〔HG⁃U133Plus2.0〕Affymetrix人类基因组U133Plus2.0阵列的数据,包括33个肿瘤样本和24个正常样本;GSE127265是基于AffymetrixHumanClariomDAs⁃say平台的数据集,它涵盖了7个CC样本和3个正常宫颈样本;GSE173097是基于GPL16956平台Ag⁃ilent⁃045997ArraystarhumanlncRNAmicroarrayV3(ProbeNameVersion)平台的数据,它涵盖了5个CC样本和6个正常宫颈样本｡

1.2表达差异分析针对GSE9750､GSE127265和GSE173097数据集中的DEGs,通过R4.0.3软件“limma”工具包,对CC组织和正常组织的mRNA表达差异分析｡对于符合P值[假发现率(FDR)P]<0.05且|log2差异倍数(FC)|>1为DEGs的筛选标准,通过R软件中的ggplot2包在火山图中被可视化,利用Venndiagram在线工具找出不同数据集DEGs的交集,以便于观察DEGs的共表达｡

1.3功能富集分析通过对DEGs进行基因本体论(GO)富集分析〔7〕和京都基因与基因组百科全书(KEGG)通路分析〔8〕,研究其主要功能和参与信号通路的情况｡采用R软件中的clusterProfiler包〔9〕和enrichplot包来探索DEGs参与的信号通路之间的功能,并采用ggplot2包来直观显示输出结果｡

1.4核心基因的蛋白质互作(PPI)网络构建和枢纽基因的选择本文在STRING数据库〔10〕中搜索核心基因,获得核心基因编码蛋白质之间的PPI关系,构建标准相互作用得分>0.9的网状结构｡最后,通过Cytoscape软件中的CytoHubba插件对得到的PPI网络进行可视化处理,并通过最大割裂中心度(MCC)算法〔11〕将网络中排名前3的基因确定为核心基因｡

1.5CC组织的来源CC组织样本均收集自2022年1月至2023年1月湖北文理学院附属医院襄阳市中心医院妇科接受手术治疗的CC住院患者｡所有纳入患者术前未曾接受过放､化疗或免疫治疗,且病历资料完整｡正常宫颈标本取材于同时期因CC行子宫全切术者｡所有样本的病理诊断由病理专家出具｡本研究已通过医院伦理委员会的审查(批件号:2023⁃022),所有患者已签署豁免知情申请书｡

1.6苏木素⁃伊红(HE)染色将已经融化好的石蜡倒入脱水透明后的组织中,放入溶蜡箱中保温一段时间,待石蜡液完全渗入组织块中,再用石蜡液包埋(石蜡液的体积最好大于组织体积的10倍),冷却凝固成块,以便实验中切片｡将包埋好的组织蜡块,放在切片机上并固定,切成3~4μm的薄片,通过HE染色后封片观察｡

1.7细胞培养人CC细胞系HeLa和人宫颈细胞系H8均购自美国菌种保存中心(ATCC)｡人CC细胞系HeLa和人宫颈细胞系H8均常规培养(37℃,5%CO2)于含10%胎牛血清及1%青⁃链霉素的高糖DMEM培养基中,胎牛血清(FBS)购自美国Invitrogen公司;高糖DMEM培养基购自美国Gibco公司｡

1.8实时荧光定量⁃聚合酶链反应(qRT⁃PCR)检测周期素依赖性蛋白激酶抑制物(CDK)1､拓扑异构酶Ⅱα(TOP2A)和Aurora激酶(AURK)BmRNA表达水平使用Trizol试剂从样本组织和细胞中提取总RNA,并用酶标仪测定浓度｡然后,借助biosharp反转录酶将RNA反转录为cDNA,备用或-20℃保存｡按照biosharp荧光定量PCR试剂盒说明书操作,使用赛默飞有限公司的ABI7500实时荧光定量PCR仪进行扩增反应｡qRT⁃PCR引物序列(5′⁃3′):CDK1上游GGAGAAGGTACCTATGGAGTTGTG,下游:AGCACATCCTGAAGACTGACTAT;TOP2A上游ACGGAATGACAAGCGAGAAGTAA,下游:GCCAA⁃AGAGCTGAGCATTGTAAA;AURKB上游TGCATCA⁃CACAACGAGACCTATC,下游:GAGTGAATGACA⁃GGGACCATCAG;GAPDH上游GGAGTCCACTG⁃GCGTCTTCA,下游:GTCATGAGTCCTTCCACGAT⁃ACC｡

1.9Western印迹将Hela细胞在细胞裂解缓冲液(RIPA)中进行裂解,提取的蛋白质在10%十二烷基硫酸钠⁃聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS⁃PAGE)上分离并转移到聚偏氟乙烯(PVDF)膜上｡然后,膜在室温下用5%的脱脂牛奶封闭1h,在4℃下用抗体孵育过夜,并在室温下用抗体孵育2h,小鼠抗GAPDH､兔抗CDK1,兔抗TOP2A和兔抗AU⁃RKB,一级抗体(ABclonal,中国)｡使用SuperSig⁃nal化学发光试剂(Illinois,美国)对蛋白膜进行量化分析｡

1.10统计学分析采用GraphPadPrism7软件进行数据处理,数据均符合正态分布且方差齐｡组间比较选用双尾t检验｡

2、结果

2.1CC的DEGs基于数据集GSE127265､GSE9750和GSE173097,使用R软件包limma来识别正常样本和宫颈癌组样本间DEGs,并用火山图显示｡GSE127265数据集中得到3246个DEGs,包括1687个上调基因和1559个下调基因｡GSE9750表达矩阵中得到1612个DEGs,包括1228个上调基因和384个下调基因｡在GSE173097表达矩阵中得到了3093个DEGs,包括1864个上调基因和1229个下调基因｡通过Venndiagram在线工具,将GSE127265､GSE975和GSE173097数据集中DEGs做交集,得到106个DEGs｡见图1､图2｡

图1DEGs中共同表达基因的Venn图

图2数据集GSE127265､GSE9750和GSE173097中的DEGS

2.2DEGs的功能富集分析如表1所示,给出了前8个重要GO富集分析和KEGG信号通路途径｡

表1106个DEGs的GO功能注释及KEGG信号通路分析

2.3PPI网络的构建和枢纽基因的鉴定通过STRING数据库,基于106个DEGs构建PPI网络｡通过Cytoscape软件中CytoHubba插件的MCC算法,从PPI网络中选出MCC分数高的前3个基因作为核心基因,包括CDK1､TOP2A和AURKB｡见图3､图4｡

图3PPI网络

图4前3个关键基因

2.4CDK1､TOP2A和AURKB在CC组织中表达利用GSE127265､GSE975和GSE173097数据集中得到CDK1､TOP2A和AURKB的DEGs｡与正常宫颈组织相比,CC组织中CDK1､TOP2A和AURKBmRNA及蛋白表达显著升高(P<0.05)｡与正常宫颈组织相比,CC组织结构排列紊乱,细胞核大深染,异型性明显,核分裂多见;与GEO数据集分析结果结论一致｡见表2､图5､图6｡

表2不同组织CDK1､TOP2A､AURKBmRNA及蛋白表达比较(x±s,n=3)

图5宫颈组织染色和相关基因表达(×20)

图6各组CDK1､TOP2A和AURKB在细胞中蛋白表达

3、讨论

CC是一种恶性肿瘤,其发病率仅次于乳腺癌｡虽然CC的预防和治疗已经有了很大的改善,但晚期CC患者的预后和生存率很差｡CC的发展是一个复杂的过程,阐明肿瘤发生的潜在分子机制将对CC的诊断､治疗和预后评估至关重要｡基于数据库的生物信息学分析被越来越多地采用,以筛选出可能对肿瘤的诊断和治疗具有指导作用的靶向生物分子〔12〕｡

TOP2A是TOP2家族的两个成员之一,另一个是TOP2B,只在循环细胞中表达,在DNA链的复制过程中负责酶解耦合〔13〕｡TOP2A对DNA复制､染色体凝聚和有丝分裂过程中姐妹染色单体的分离至关重要,并在转录启动中发挥重要作用〔14〕｡据报道,与邻近的正常组织相比,TOP2A在结肠癌组织中过度表达,而且TOP2A被敲除后,结肠癌HCT116和SW480细胞的增殖和侵袭能力明显下降,并促进细胞凋亡〔15〕｡Ma等〔15〕借助生物信息学分析和免疫组化技术发现,TOP2A在非小细胞肺癌(NSCLC)中与正常肺组织相比过度表达,这与NSCLC患者的总生存率较差有关｡此外,在CC中发现,TOP2A在宫颈癌组织中过表达,通过激活磷脂酰肌醇⁃3激酶(PI3K)/蛋白激酶B(AKT)信号促进CC细胞迁移､侵袭和上皮间质转化(EMT)〔16〕｡本研究推测,TOP2A与CC病变有关,这为CC的发生发展提供新思路｡

CDK1是一种丝氨酸/苏氨酸类蛋白激酶,是重要的细胞周期调节器,可调节细胞分化和增殖,在促进细胞周转方面发挥着重要作用〔17〕｡CDK1是细胞增殖过程中唯一具有关键意义的激酶,在各种原发性癌症中都观察到CDK1异常表达〔18〕｡CDK1在参与CC进展的遗传网络调控中起复杂的作用〔19〕｡据报道,Sp1上调CDK1有助于减少CC细胞的G2/M停滞,并增强其抗辐射能力〔20〕｡值得注意的是,通过生物信息学的预测,CDK1在宫颈癌中过表达,结果发现CDK1是miR⁃143⁃3p和miR⁃495⁃3p的共同靶基因,在miR⁃143⁃3p或miR⁃495⁃3p过表达或CDK1沉默的情况下,CC细胞的生存能力受到抑制,而促进细胞凋亡〔21〕｡本研究中通过生信分析和实验验证,CDK1在CC组织中过表达,推测CDK1与CC的关系,由于未采用动物实验进一步证明,这提出了下一步研究工作的方向｡

Aurora是一个丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶家族,从发芽酵母到哺乳动物都是高度保守的,它们调节细胞周期的许多重要过程｡在哺乳动物中,Aurora家族有3个成员:AURKA､AURKB和AURKC〔22〕｡AURKA在S期晚期/G2期早期与中心体结合,并分离到纺锤体两极和纺锤体微孔,在中心体成熟和纺锤体组装中起着重要作用〔23〕｡AURKB是染色体客体复合体(CPC)蛋白之一,在细胞周期进展中具有动态的亚细胞定位〔23〕｡根据染色体CPC蛋白在有丝分裂过程中的移动特性,AURKB可能在协调染色体凝聚､动点⁃微管附着､染色体定向､建立成熟期板和有丝分裂过程中的细胞骨架事件中发挥关键作用〔23〕｡研究发现,AURKB经常被检测到在多种人类肿瘤中过度表达,在人类癌症的发展中发挥着许多重要功能〔24〕｡Fu等〔25〕报道,AURK抑制剂VE465能够增强卡铂在人类卵巢癌细胞中的抗肿瘤活性｡Fiskus等〔26〕在人乳腺癌细胞中使用了涉及泛AURKB抑制剂MK⁃0457和伏立诺他的联合治疗,抑制AURKA和AURKB的活性,导致乳腺癌细胞凋亡｡本研究结果可知,在CC组织中AURKB过表达,其参与CC病变的过程,促进CC发生､发展｡

综上,基于GEO数据库分析的结果,确定TOP2A,CDK1和AURKB在CC中的预后价值和潜在的生物学功能｡临床试验和细胞实验结果发现,与正常宫颈组织相比,TOP2A､CDK1和AURKB在CC中均明显表达,这3个基因可能作为CC新的分子标志物,可为进一步验证基因功能奠定基础,并为CC的诊断及治疗带来新的方向｡

文章来源:李建雨,石欢,贾新涛,等.基于生物信息学分析筛选宫颈癌相关的分子标志物[J].中国老年学杂志,2025,45(07):1583-1588.