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骨肉瘤干细胞功能性单抗9B8靶向骨肉瘤的实验研究

2023-08-07 48 上传者：管理员

摘要：目的探讨靶向骨肉瘤干细胞单抗9B8的生物学特征及其联合顺铂治疗骨肉瘤的疗效。方法细胞免疫荧光法检测单抗9B8识别的抗原蛋白与骨肉瘤干细胞表明标志物(CD133)在骨肉瘤MG-63细胞中的表达情况。流式细胞术分选出的9B8+细胞检测其自我更新、侵袭和耐药能力。CCK8法检测单抗9B8对MG-63细胞自我更新和顺铂耐药能力的影响。裸鼠体内治疗实验分析单抗9B8联合顺铂对MG-63细胞移植瘤生长的抑制作用。结果免疫荧光显示单抗9B8识别的抗原分子与CD133在MG-63上共定位。9B8+细胞无血清成球、侵袭能力和耐药性高于9B8-细胞。9B8+细胞和9B8-细胞的IC50分别为0.9133和0.4012μmol/L。单抗9B8对MG-63的成球抑制率为55.6%。经单抗9B8处理后的MG-63，耐药能力明显下降，其IC50为0.2191μmol/L。单抗9B8体内治疗结果表明40、10、2.5 mg/kg的9B8组的抑制率分别为80.1%、54.2%和43.9%,40 mg/kg 9B8联合顺铂组抑制率为90.1%，顺铂组抑制率为48.6%。结论单抗9B8是抗骨肉瘤干细胞的功能性单抗。

关键词：
CD133
单克隆抗体
恶性肿瘤
顺铂
骨肉瘤干细胞
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骨肉瘤是骨科常见的恶性肿瘤，好发于青少年，骨肉瘤具有明显的转移特性。一旦发生转移，则预后差，其5年平均的生存率为20%～30%[1,2]。目前对于影响骨肉瘤侵袭和转移的分子机制尚不明确。因此，降低骨肉瘤复发转移的发生，探究复发转移发生发展的机制非常重要。骨肉瘤患者预后通过手术和化疗的组合，5年生存率已取得明显改善。然而，有相当数量患者对化疗不敏感或产生耐药性。目前，可用的化疗方案十分有限。因此，阐明骨肉瘤耐药性潜在机制至关重要。

许多研究表明，骨肉瘤干细胞（osteosarcoma stem cells,OSCs）是骨肉瘤中一小群具有无限增殖、多药耐药和高致瘤性等特点的细胞[3,4,5]。骨肉瘤干细胞被越来越多的研究所证实，并利用多种表面标记物、多能干细胞标记物和其他特性进行了初步分离，如CD133、ALDH1、CD117/Stro-1和CD271等[6,7,8,9]。骨肉瘤干细胞标志物和其相关靶点的研究证明其对骨肉瘤的发生发展起着关键作用，对研究骨肉瘤耐药机制具有重大意义。

利用本研究室的大容量功能性单克隆抗体库技术平台，研究人员从骨肉瘤组织中分离、鉴定出骨肉瘤干细胞，并将其免疫Balb/c小鼠，成功建立了抗人骨肉瘤干细胞单克隆抗体，并通过骨肉瘤组织特异性筛选获得高特异性单抗9B8[10]。为了获得抑制耐药的功能性单克隆抗体，选择骨肉瘤癌细胞系MG-63为细胞模型，对抗骨肉瘤干细胞候选单抗9B8进行鉴定和功能研究，以期为靶向骨肉瘤干细胞治疗骨肉瘤提供候选单克隆抗体。

1、材料与方法

1.1材料

1.1.1主要试剂

骨肉瘤细胞系MG-63和9B8杂交瘤单克隆抗体由北京市创伤骨科研究所骨库保存，胎牛血清购自FBS公司；B27、b FGF、EGF、RPMI-1640购自美国Gibco公司；抗人PE-CD33抗体购自德国美天旎公司；FITC-Mouse二抗购自美国Jackson公司；顺铂购自美国Pfizer公司；Matrigel购自美国Corning公司。

1.1.2实验动物

Balb/c雌性小鼠35只，4～6周龄，SPF级动物（SYXK(京)2023-0021），购自北京维通利华，饲养于北京市创伤骨科研究所。

1.1.3仪器

CO2细胞培养箱和流式细胞仪为美国Thermo公司产品；倒置相差显微镜为日本Olympus公司产品。

1.2方法

1.2.1骨肉瘤MG-63的成球培养

MG-63细胞置于RPMI-1640完全培养基下，消化至单个细胞，制备细胞密度2×104/ml，接种DMEM/F12无血清培养基含（B27、b FGF和EGF），在37℃的5%CO2的条件下培养11 d，用于后续实验。

1.2.2流式细胞分析MG-63的9B8和CD133双荧光标记定位检测

MG-63接种于96孔培养板（4×103个/孔）中，PBS洗1次；4%的多聚甲醛室温下固定15 min；固定细胞洗液洗3遍，0.02%Triton X-100作用5 min,10%正常马血清10 min。加入一抗PE-133直标抗体和9B8抗体，免疫血清作为阳性对照，正常鼠血清、SP2/0上清、PBS作为阴性对照，室温孵育1 h；固定细胞洗液洗涤5次，每次5 min；加入100μl的FITC-Mouse二抗，避光室温孵育30 min；固定细胞洗液洗涤5次，每次5 min;50μl含10μg/ml DAPI、50%甘油的PBS封闭；荧光显微镜下观察。

1.2.3流式细胞分选MG-63的9B8+细胞

将对数期的MG-63单细胞悬液，1200 r/min离心5 min后，PBS洗1遍，重悬至1×107个/ml。加入单克隆抗体9B8，室温孵育1 h,PBS洗涤1次。加入二抗，避光孵育30 min,PBS洗涤后用含1%BSA的PBS重悬，流式荧光细胞分选9B8+细胞。

1.2.4 9B8+细胞自我更新能力的检测

分选MG-63中9B8+细胞、亲本细胞和9B8-细胞，以500个/孔接种于无血清悬浮培养基的低黏附24孔板培养，在37℃、5%CO2条件下培养11 d观察成球情况，计算成球率=每孔成球数/500×100%。

1.2.5 9B8+细胞侵袭能力的检测

分选9B8+细胞、亲本细胞和9B8-细胞，将Matrigel用不含血清的培养基在冰上操作稀释成1μg/μl，上室加入60μl稀释胶，室温固化1 h，弃稀释液，培养基洗1次；Transwell下室加600μl的完全培养基，上室加100μl细胞悬液，37℃、5%CO2继续培养24 h。取出上室，用干棉球擦去上室的细胞，甲醇室温固定15 min，晾干，0.1%结晶紫染色15 min。光学显微镜拍照计数，每个培养孔随机选择3个视野拍照，计算每个视野的细胞数。

1.2.6 9B8+细胞顺铂耐药性的检测

分选9B8+细胞、亲本细胞和9B8-细胞，以5000个/孔接种96孔板，用含0、0.3125、0.625、1.25和2.5μmol/L顺铂培养基培养7 d，加入CCK8试剂，检测波长450 nm处的吸光度（A）值，计算各组的半数抑制浓度（IC50）和死亡率（%）。

1.2.7单抗9B8对

MG-63细胞成球能力的影响消化处于对数生长期的MG-63细胞成单细胞，用单抗9B8(400μg/ml）与细胞共孵育，37℃孵育2 h,500个/孔的细胞密度接种含无血清悬浮培养基的低黏附24孔板中，11 d后计算成球率。

1.2.8单抗9B8对

MG-63细胞顺铂耐药能力的影响消化处理MG-63细胞，以5000个/孔的细胞密度接种96孔板中，加入400μg/ml单抗9B8,CO2孵箱中培养24 h后，移去含抗体的完全培养基，用含0、0.3125、0.625、1.25、2.5、5、10μmol/L的顺铂培养基培养，培养48 h后更换含顺铂的完全培养基，培养7 d，采用CCK8法测定波长450 nm处的A值，计算各组的IC50。

1.2.9 Balb/c裸鼠体内耐药实验

裸鼠共35只，随机分为7组，每组5只，顺铂组（0.6 mg/kg）、40 mg/kg 9B8组、10 mg/kg 9B8组、2.5 mg/kg 9B8组、40 mg/kg 9B8+顺铂组和2.5 mg/kg 9B8+顺铂组。将MG-63以5×106个/只接种裸鼠，第2天开始对照组和实验组通过腹腔注射进行治疗，每周2次，治疗1个月后各组均停止用药。每周测量裸鼠皮下肿瘤的长径和短径，计算肿瘤体积V=（π/6）×长径×短径2。停药后的2个月继续测量肿瘤体积。

1.3统计学处理

应用SPSS13.0软件统计分析，计数资料差异采用χ2检验，组间差异采用t检验，P<0.05时有统计学差异。

2、结果

2.1人骨肉瘤细胞系MG-63中的CD133与单抗9B8共表达情况

流式细胞检测表明MG-63中CD133+细胞表达率为5.1%,9B8+细胞表达率为3.4%,CD133和9B8双阳细胞的表达率为1.6%（图1）。双色细胞免疫荧光检测显示，CD133能与9B8在MG-63细胞上共定位（图2),CD133骨肉瘤干细胞可被单抗9B8识别，提示9B8是识别骨肉瘤干细胞CD133的单克隆抗体。

图1 MG-63细胞中9B8和CD133双染的流式检测

图2 MG-63细胞中9B8和CD133共染情况（×400)

2.2 9B8+细胞具有更强的自我更新能力

从MG-63中流式分离出的9B8+细胞、9B8-细胞和亲本细胞无血清成球培养。图3显示，9B8+细胞、9B8-细胞和亲本细胞的成球率分别为（14.6±1.1）%、（5.6±1.3）%和（11.8±0.9)%,9B8+细胞的成球率显著高于9B8-细胞和亲本细胞（P<0.01）。表明9B8+细胞相比亲本细胞和9B8-细胞展示更强的自我更新能力，具有肿瘤干细胞的特征。

图3 MG-63中9B8+、9B8-细胞和亲本细胞的自我更新能力比较

2.3 9B8+细胞具有更强的侵袭能力

分选MG-63细胞中9B8+细胞、9B8-细胞和亲本细胞，Transwell实验（图4）显示，9B8+细胞的侵袭数为（110.3±8.8），明显高于9B8-细胞（25.8±4.6）和亲本细胞（59.3±5.4)(P<0.0001）。结果表明，9B8+细胞与9B8-细胞相比具有更强的侵袭能力。

2.4 9B8+细胞具有更高的顺铂耐药性

检测不同浓度顺铂作用通过CCK8法检测9B8+细胞的死亡率，结果见表1。9B8+细胞、9B8-细胞和亲本细胞的IC50分别为0.9133、0.4012和0.4789μmol/L，与亲本细胞和9B8-细胞比较，9B8+细胞的耐药性明显强于两者。表明单抗9B8识别的细胞具有抵抗化疗药物的干性特性。

2.5单抗9B8对MG-63细胞自我更新能力的影响

单克隆抗体9B8处理组的成球数为（24.8±4.3）个，而对照组的成球数为（55.8±5.3）个。结果显示（图5），单抗9B8能显著抑制MG-63细胞的成球数（P<0.0001），提示单抗9B8能够抑制骨肉瘤细胞的自我更新能力。

图4 MG-63的9B8+细胞（A）、9B8-细胞（B）和亲本细胞（C）的侵袭能力的比较

表1 9B8+细胞、亲本细胞和9B8-细胞在不同浓度顺铂作用下的死亡率（%，x±s;n=3)

图5 9B8单抗对MG-63细胞自我更新能力的抑制

2.6单抗9B8对MG-63细胞顺铂耐药能力的影响

经单抗9B8处理后的MG-63细胞，其顺铂耐药能力明显随之下降，IC50值为0.2191μmol/L，对照组的IC50值为0.4841μmol/L（图6）。表明单抗9B8能够有效抑制骨肉瘤细胞对顺铂的耐药性。

图6单抗9B8降低骨肉瘤细胞的顺铂耐药能力（*P<0.05,**P<0.01)

图7单抗9B8联合顺铂抑制骨肉瘤移植瘤的生长曲线

2.7单抗9B8对骨肉瘤移植瘤生长的影响

单抗治疗后对骨肉瘤移植瘤的影响，其中不同单抗浓度和化药联用59 d后，40、10、2.5 mg/kg的单抗9B8对骨肉瘤移植瘤生长的抑制率分别为80.1%、54.2%和43.9%,40 mg/kg 9B8+顺铂对骨肉瘤移植瘤生长的抑制率为90.1%，顺铂组的骨肉瘤生长抑制率为48.6%（图7）。表明单抗9B8靶向骨肉瘤干细胞能明显抑制肿瘤生长。

3、讨论

骨肉瘤是目前预后差、复发率高的骨常见恶性肿瘤，尤其严重影响青少年的身体健康和生活质量。近年来治疗骨肉瘤并没有好办法，实际治疗效果不好，并且骨肉瘤细胞耐药特性常使化疗达不到预期效果。近年来，随着对肿瘤治疗的靶向和分子治疗研究的深入，肿瘤干细胞研究成为骨肉瘤治疗的新突破口，并期望能够带来新的治疗方法。

Gibbs等[11]首先报道人骨肉瘤组织中和人骨肉瘤细胞系中存在一个亚群细胞，其可以生长成骨肉瘤细胞球。同时，CD133已证实为骨肉瘤干细胞的表面标志物[12]。本实验室已证明骨肉瘤MG-63细胞系中存在一些细胞可以在悬浮下生长，以及其他骨肉瘤干细胞存在的证据[13]。由于骨肉瘤干细胞被认为是骨肉瘤的肿瘤起始细胞，所以针对性“删除”骨肉瘤干细胞或许可以达到治愈骨肉瘤的效果。

本研究中人骨肉瘤MG-63中骨肉瘤干细胞标志物CD133与单抗9B8共定位，提示单抗9B8靶向骨肉瘤干细胞。为了证明单抗9B8靶向骨肉瘤干细胞，采用流式细胞术分选MG-63中9B8+细胞进行体外功能实验。结果显示，9B8+细胞体外成球能力、侵袭和耐药性明显高于9B8-细胞，初步表明单抗9B8识别的骨肉瘤细胞具有肿瘤干细胞的特征。进一步研究单抗9B8对骨肉瘤细胞的体外功能，结果显示，9B8对MG-63细胞的成球抑制率达到了55.6%；在顺铂耐药实验中，其IC50由0.4841μmol/L降低至0.2191μmol/L，体现了经单抗9B8处理的细胞对顺铂耐药的抑制性。结果提示，单抗9B8是一个抗骨肉瘤干细胞的功能性单克隆抗体。

为了研究单抗9B8靶向骨肉瘤干细胞抑制骨肉瘤移植瘤的生长情况，我们进行了小鼠骨肉瘤移植瘤体内治疗实验。结果显示，40、10、2.5 mg/kg单抗9B8对骨肉瘤移植瘤生长的抑制率分别为80.1%、54.2%和43.9%,40 mg/kg 9B8+顺铂对骨肉瘤移植瘤生长的抑制率为90.1%，顺铂组的肿瘤生长抑制率为48.6%。表明单抗9B8靶向骨肉瘤干细胞治疗骨肉瘤的疗效显著优于化疗药物。这些研究还表明，单抗与顺铂联合应用方案可能是抗体靶向肿瘤干细胞治疗骨肉瘤的最佳方案之一。但单抗9B8所识别的抗原仍需鉴定，明确其靶标分子，以期为靶向骨肉瘤干细胞治疗骨肉瘤提供有应用潜力的分子靶标。

总之，本研究表明单抗9B8能够识别MG-63细胞中CD133+细胞，并抑制其干性功能特征，单抗9B8联合顺铂抑制小鼠骨肉瘤移植瘤的生长，为肿瘤的靶向治疗提供新策略和思路，有望成为抗骨肉瘤干细胞的靶向治疗药物。下一步将分离单抗9B8识别的抗原蛋白分子，获得相应的功能性分子靶标，为筛选靶向骨肉瘤干细胞的其他药物奠定基础，将为靶向肿瘤干细胞治疗骨肉瘤复发、转移提供抗体靶向药物。

基金资助：北京自然科学基金面上项目（7222012）；

文章来源：马晓雯,陈磊,郑蕊等.骨肉瘤干细胞功能性单抗9B8靶向骨肉瘤的实验研究[J].中国医药生物技术,2023,18(04):298-303.