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血浆代谢相关生物标志物检测在转移性结直肠癌诊断中的应用

2024-04-11 43 上传者：管理员

摘要：目的通过靶向代谢组学探讨非转移性结直肠癌(nmCRC)和转移性结直肠癌(mCRC)患者的新生物标志物和治疗策略。方法选取2022-01-01-2023-01-01山东省肿瘤医院招募的30例nmCRC患者和30例年龄和性别与之匹配的mCRC患者。采集nmCRC和mCRC患者血浆样本，使用液相色谱法-串联质谱法检测氨基酸、胆汁酸和脂肪酸的血浆代谢物，并分析其相关性及诊断价值。结果共检测到27种氨基酸、16种脂肪酸和9种胆汁酸，其中乙醇胺(P=0.017)、牛磺酸(P=0.003)和色氨酸(P=0.013)、甘氨胆酸(P=0.015)、C15∶0(P=0.001)、C17∶1(P=0.005)、C17∶0(P=0.037)、C18∶3(P=0.021)、C18∶2(P=0.007)、C20∶3(P=0.024)、C20∶1(P=0.011)、C22∶5(P=0.028)、C24∶1(P=0.017)表达下降。受试者工作特征曲线(ROC)分析显示13种代谢标志物诊断mCRC的曲线下面积(AUC)范围为0.668～0.809,可以很好地区分nmCRC和mCRC。其中GCA和CA19-9具有良好的相关性，r=0.736,P=0.036。nmCRC和mCRC患者平均CA19-9值分别为25.25±35.67和1 020.56±2 545.23,t=-2.142,P=0.036。CA19-9或GCA单独分析CRC肝转移患者AUC值分别为0.768和0.677,CA19-9和GCA联合分析时AUC值为0.828。结论代谢组学呈现了一种针对CRC的新颖无创识别方法，有望成为一种用于诊断mCRC的有效方法。

关键词：
nmCRC
代谢组学
液相色谱法-串联质谱法
结直肠癌
血浆代谢相关生物标志物
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在人类恶性肿瘤中，结直肠癌(colorectal cancer, CRC)发病率排名第三，同时是全球导致癌症相关死亡的第二大原因[1],结直肠癌包括非转移性结直肠癌(non-metastatic colorectal cancer, nmCRC)和转移性结直肠癌(metastatic colorectal cancer, mCRC)。早期CRC患者5年生存率可达90%。然而，能够存活5年以上的mCRC患者低于12%[2,3]。此外，大约25%的CRC患者在诊断时已有远处转移，且以肝转移最为常见。目前，化疗联合靶向疗法、免疫疗法已经广泛运用，但在疗效方面并没有突破性的进步，且中位总生存时间仅有30个月[4,5,6]。

肠镜活检或肿瘤穿刺是诊断CRC的标准，但这种方法属于侵入性检查，易导致患者的耐受性差，以及穿孔和出血等并发症的发生，且样本并不能代表全部肿瘤的瘤内异质性和分子纵向特征[7,8]。癌胚抗原(carcinoembryonic antigen, CEA)检测灵敏度低不适用于早期检测。CRC患者的血液可以在肿瘤组织中循环，可以更好地反映肿瘤的瘤内异质性和分子纵向特征，且获取血液样本几乎是无创的[9,10]。液体活检能够通过检测核酸、蛋白质和血液中的外泌体来表征CRC患者的分子谱，并为疾病诊断和治疗监测提供基础[11,12]。基因组学能够评估CRC易感性和家族风险性，与基因组学相比，转录组学和蛋白质组学与CRC组织的表型状态联系更紧密[13,14]。细胞代谢位于其他组学的下游，与生物学表型具有最直接的关系，前期研究显示，血浆代谢物特别是氨基酸、胆汁酸和脂肪酸，这三者是最常见的失调代谢标志物，常用于筛选CRC和癌前病变，可用于从腺瘤中鉴别CRC[10]。此外，关于CRC相关代谢标志物方面的研究以及血浆代谢组学在mCRC的应用的报道很少[15,16,17,18]。本研究采用血浆代谢相关生物标志物检测mCRC,显示出血浆代谢组学可能是一个用于诊断mCRC以及检测潜在的治疗靶点的有效方法。

1、对象与方法

1.1 病例选择及一般资料

选取2022-01-01-2023-01-01山东省肿瘤医院招募的30例nmCRC患者和30例年龄和性别与之匹配的mCRC患者。nmCRC患者男8例，女22例；年龄32～79岁，平均年龄(60.13±10.42)岁。mCRC患者男11例，女19例；年龄32～79岁，平均年龄(60.53±12.67)岁；肝转移16例，肺转移6例，腹膜转移2例，其它部位转移6例。研究经山东省肿瘤医院伦理委员会批准(2022003135),获得受试者的书面知情同意后采集患者静脉血。受试者术前均未接受过任何治疗，分离nmCRC和mCRC患者血浆-80 ℃保存。

1.2 样本处理

代谢物提取时，将50 μL血浆与氨基酸(100 μL含内标品的磺基水杨酸溶液)、胆汁酸(200 μL含内标品的甲醇)、脂肪酸(200 μL含内标品的甲醇)提取试剂混合，4 ℃ 15 000 r/min离心15 min(r=10 cm)。对于氨基酸，将10 μL上清液、70 μL硼酸盐缓冲液和20 μL AQC试剂转移到相同的1.5 mL摇匀管中震荡10 s。然后将20 μL上清液和180 μL水加入到96孔板，进行液相色谱-串联质谱分析。对于胆汁酸和脂肪酸，将100 μL上清液和100 μL水加入到96孔板。LC-质谱分析采用UPLC系统和四联电喷雾电离质谱仪进行。使用MassLynx软件(4.1版，Waters, USA)对原始数据进行处理和集成。

1.3 液相色谱与质谱条件

1.3.1 色谱条件

氨基酸中流动相A:0.1%甲酸水，流动相B:0.1%甲酸乙腈，洗脱梯度程序：0 min, 1%B;0～1 min, 1% B;1～2 min, 13% B;2～5.5 min, 15% B;5.5～6.5 min, 95% B;6.5～7.5 min, 95% B;7.5～7.6 min, 1% B;7.6～9 min, 1% B。柱温箱：55 ℃;进样室：10 ℃;进样量2 μL。胆汁酸中流动相A:0.01%甲酸水，流动相B:乙腈，异丙醇(1∶1,含0.01%甲酸),洗脱梯度程序：0 min, 20% B;0～0.1 min, 20% B;0.1～1.5 min, 55% B;1.5～2.0 min, 70% B;2.0～2.5 min, 98% B;2.5～3.0 min, 20% B。柱温箱：60 ℃;进样室：10 ℃;进样量2 μL。脂肪酸中流动相A:0.01%甲酸水，流动相B:乙腈，异丙醇(1∶1,含0.01%甲酸),洗脱梯度程序：0 min, 50% B;0～1.2 min, 98% B;1.2～1.7 min, 98% B;1.7～3.0 min, 50%B。柱温箱：60 ℃;进样室：10 ℃;进样量2 μL。

1.3.2 质谱条件

氨基酸电离模式：ESI +;毛细管电压：1 kV;脱溶剂气温度：550 ℃;脱溶剂气流量：1 000 L/h; 源温度：150 ℃。胆汁酸电离模式：ESI -;毛细管电压：3 kV;脱溶剂气温度：550 ℃;脱溶剂气流量：1 000 L/h; 源温度：150 ℃。脂肪酸电离模式：ESI -;毛细管电压：3 kV;脱溶剂气温度：550 ℃;脱溶剂气流量：1 000 L/h; 源温度：150 ℃。

1.4 统计学方法

代谢组学数据分析使用OmicStudio工具(https: //www.omicstudio.cn)和OECloud工具(https: //cloud.oebiotech.com)。使用偏最小二乘判别分析得分，模型-检验图采用R 4.0.3进行分析。使用OECloud将堆叠交互图进行可视化。差异代谢物采用t检验进行分析，以错误发现率(false discovery rate, FDR)值，q<0.05,log2 FC >1作为筛选标准。采用OmicStudio进行受试者工作特征曲线(receiver operating characteristic curve, ROC)绘制并分析差异代谢物识别mCRC的能力。使用OECloud对差异代谢物进行随机森林分析。采用Pearson分析差异代谢物与CEA和糖类抗原19-9(carbohydrate antigen 19-9,CA19-9)相关性，数据以表示。检验水准α=0.05(双尾)。

2、结果

2.1 差异代谢物

氨基酸检测到27种，其中乙醇胺(ethanolamine, ETA;P=0.017)、牛磺酸(taurine, Tau; P=0.003)和色氨酸(tryptophan, Trp; P=0.013)表达下调；胆汁酸检测到9种，只有甘氨胆酸(glycocholic acid, GCA;P=0.015)表达下调；脂肪酸检测到16种，其中C15∶0(P=0.001)、C17∶1(P=0.005)、C17∶0(P=0.037)、C18∶3(P=0.021)、C18∶2(P=0.007)、C20∶3(P=0.024)、C20∶1(P=0.011)、C22∶5(P=0.028)、C24∶1(P=0.017)下降。见图1。

图1 差异表达代谢产物鉴定结果

2.2 差异代谢产物对mCRC患者诊断价值

ROC曲线结果显示，差异代谢产物诊断mCRC曲线下面积(area under curve, AUC)范围为0.668～0.809,均具有较强的鉴别mCRC能力。见图2。

图2 差异代谢产物诊断mCRC患者ROC曲线

2.3 随机森林分析预测标志物

采用随机森林法预测差异代谢产物区分nmCRC和mCRC的平均基尼指数下降值，前3名标志物为Tau、GCA和C18∶2,三者联合检测AUC为0.856。见图3和图4。

图3 随机森林法预测代谢产物重要性

图4 Tau和GCA及C18∶2联合诊断转移性结直肠癌受试者工作特征曲线

2.4 mCRC患者差异代谢产物与临床指标相关性

相关性分析发现，GCA和CA19-9具有良好的相关性，r=0.736,P=0.036(表1)。nmCRC和mCRC患者平均CA19-9值分别为25.25±35.67和1 020.56±2 545.23,t=-2.142,P=0.036。CA19-9或GCA单独分析CRC肝转移患者AUC值分别为0.768和0.677,CA19-9和GCA联合分析时AUC值为0.828。见图5。

表1 重要差异代谢产物相关性分析

3、讨论

CRC可通过淋巴管和血源性播散以及邻近和腹膜途径传播，最常见的转移部位是区域淋巴结、肝脏、肺和腹膜。传统的检测方式如肠镜检查、强化CT、FOBT等具有其各自的局限性：肠镜检查依从性差、舒适性差且易造成附带损伤(包括但不限于麻醉耐受的问题以及肠壁损伤甚至穿孔),对于肠外转移更是无能为力；强化CT能够识别肠管增厚和占位但无法辨别良恶性，且无法如肠镜那样直观观察肿块并取样；FOBT无法辨别痔疮、肠道非肿瘤性出血与肿瘤出血，且相当一部分患者并非因便血就诊。常用的CRC标志物，如CEA和CA19-9由于灵敏度低不适用于早期检测。因此，目前迫切需要方便有效、经济性好、能够敏感检测早期癌症的新型检测技术。

图5 GCA和CA19-9单独或联合检测mCRC肝转移患者ROC曲线

早期诊断和探索mCRC的治疗靶点对于改善CRC患者预后至关重要[3,4]。血浆代谢组学通过靶向评估反映药物治疗和遗传学效果的代谢物，提供了CRC转移的准确解释[19,20]。同时，液体活检是一种检测和监测癌症的革命性技术，可以识别和分析各种生物标志物。目前常用的CRC生物标志物来源于肿瘤、血液、尿液和粪便，可作为不同疾病状态的预后、预测和诊断标志物，其中包括特定的遗传表型、转录子、蛋白质、细胞游离DNA(cell-free DNA,cfDNA)、循环肿瘤DNA(circulating tumor DNA,ctDNA)、改变的表观遗传模式(如 DNA/组蛋白低甲基化、高甲基化或乙酰化)、外泌体、微小RNA(microRNA,miRNA)、长链非编码RNA(long non-coding RNA,lncRNA)等均可用于检测CRC。这些生物标志物具有潜在的临床用途，可用于癌症分期、对选定的治疗进行基因组、表观基因组和(或)免疫分析，以及监测患者预后。借助代谢组学分析可指出疾病的潜在分子机制，并开发新的治疗靶点和方法。代谢组学可用于研究肿瘤标志物的变化，这种非侵入性技术提供了多种好处，包括早期发现癌症的可能性，实时跟踪治疗效果的机会，以及发现任何轻微复发疾病的能力。且相对于传统的组织活检或肠镜检查等侵入性技术来说，液体活检对患者的损伤更小，不易出现出血穿孔等并发症，使癌症诊断对患者更加方便，并可以常规监测疾病进展和治疗有效性。与基因组学相比，转录组学和蛋白质组学与CRC组织的表型状态具有更紧密的联系。细胞代谢位于其他组学的下游，并参与了几乎所有的生物学进程的调节，与生物学表型具有最直接的关系，因此，代谢组学分析在CRC表型的定义和指导个性化治疗方面具有很大价值。

本研究采用靶向代谢组学技术对nmCRC和mCRC患者的血浆样本进行分析，探讨诊断性生物标志物和新的治疗靶点。本研究显示，代谢组学指标可以很好地区分nmCRC和mCRC。本研究结果表明GCA是一种很好且很有前途的识别mCRC生物标志物，联合诊断的AUC高于临床指标CEA和CA19-9,并且在mCRC中具有可靠的鉴别能力。

越来越多的研究表明，氨基酸、胆汁酸和脂肪酸靶向代谢物在肿瘤的起始和进展中至关重要[21,22,23]。氨基酸代谢异常是肿瘤中较常见的一种现象，研究表明，氨基酸可以作为肿瘤靶向治疗的试剂[24,25]。目前关于ETA肿瘤学和Tau蛋白的研究较少，但有研究发现Tau蛋白对多种肿瘤的增殖均有抑制作用[26,27]。2019年，一篇论文报道了色氨酸代谢异常存在于各种肿瘤中，可作为一种常见的治疗靶点[28]。脂肪酸与肿瘤耐药和免疫密切相关，但分析其在mCRC诊断和治疗中作用的相关研究很少。

使用差异代谢指标建立模型，同时发现该模型对于mCRC和mCRC肝转移具有很好的诊断价值，且GCA与CA19-9呈正相关，与CA19-9相比，GCA诊断mCRC更具有特异度，但与CEA相比，这些代谢物并没有展现出优势[29]。另外，CEA是一个广谱的肿瘤标记物，它不擅长识别mCRC的转移位置，因此，推测CEA数据可能由于样本量较小而发生了偏差。

综上所述，代谢组学呈现了一种针对CRC的新颖无创识别方法，有望成为一种用于诊断mCRC的有效方法。

基金资助:山东省自然科学基金面上项目(ZR2020MH254);山东省肿瘤医院临床培育项目(2020PYA05);济南市临床医学科技创新计划项目(202134062);

文章来源:尤铂文,单军奇,姚瑶,等.血浆代谢相关生物标志物检测在转移性结直肠癌诊断中的应用[J].中华肿瘤防治杂志,2024,31(07):420-425.